液相色谱基础知识

分辨率是色谱分离中主要考虑的因素
在开发色谱方法时，有很多因素是很重要
的。除分辨率之外，以下几个因素都要考
虑。
灵敏度
成本
载样量
容易使用
分析速度
色谱柱寿命
溶剂损耗
效率
Good Column
Inject
4.4% height
W1.44
Bad Column
提高柱效的方法
色谱柱本身
减小填料的颗粒度 找到最佳的流速(根据不同内径) 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长
其他影响柱效的因素
柱外效应
连接管路 进样器、检测器
进样体积 进样量
容量因子 k'
与峰高的关系
与R的关系
示差折光 电导
响应
通用 选择性
灵敏度 毫克 纳克
线性范围 104
106
流速敏感 是
是
温度敏感 是
是
梯度淋洗 不可 有限制
紫外 荧光 电化学
选择性 选择性 选择性
纳克 Picogram Picogram
105 10~103
106
否
否
是
否
否
是
可以 可以 脉冲的可以
色谱条件的优化
分离度
速度
容量
开发液相色谱方法
进样器
液相色谱的应用（一）
“分析型液相色谱” 定性及定量分析
灵敏度的要求 样品的复杂性 样品量的要求 精度及准确度的要求 容易使用
液相色谱的应用（二）
“制备型液相色谱” 分离及纯化
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
开发液相色谱方法
问题∶什么样的分离结果是好的?分辨率?
液相色谱基础知识
Waters LC School 培训教材
常见的分离方式
蒸馏 离心 电泳 过滤 超滤
色谱
色谱法的分类
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
高效液相色谱 HPLC
HPLC分离的机理
分离是一 个物理的 过程。
典型的仪器配置
色谱泵及控制器
数据处理及控制
色谱柱 检测器
Waters 486
理论塔板数计算公式：
N s V1 2
W
W
s
方法
Wtan
16 切线法
Wh
5.54 半峰高
W3s
9
3s
W4s
16
4s
W5s
25
5s
用“切线”法计算柱效
Inject Inject
N 4s
16
18.70 0.80
2 ห้องสมุดไป่ตู้
8742 plates
VR18.70
W0.80
VR16.63
N 4s
16
16 .63 0 .68
2
9569 plates
不好的色
谱柱的柱效反 而比好色谱柱 的要高，因为 其拖尾部分测 不出来
W0.68
用“5s”法计算柱效
N5
25
18.70 1.03
2
8240 plates
VR18.70
VR16.63
N5s
25
16.63 1.44
2
3334 plates
4.4% height
W1.03
改变k'值的方法∶
调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗
选择性系数 a
定义∶ atR2 t0 k 2
tR1 t0 k 1
a =1 时两组分分不开，
改变a的途径
改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质
R a 1 a
a ，k'，N∶如何控制分辨率?
液相色谱的检测模式
灵敏度、选择性、及适应能力
什么是色谱的分辨率？
分辨率的公式：
R V2 V1
1 2
(W2
W1 )
影响分辨率的因素：K’，a，N
分辨率的方程∶
Rkk1aa1 4N
k' 是容量因子，表达了样品与柱填料的作用 强弱。
a 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏
程度。是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程 度。
色谱柱的柱效 N