酵母双杂交及其衍生系统_黄欣媛

・技术与方法・

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2014年第1期

生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的基础，在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生物学的一个主要目标。1989年诞生的酵母双杂交（Yeast two -hybrid，Y2H）系统以及随后出现的各种衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和RNA、小分子化合物之间相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在细胞信号转导、蛋白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。本文对Y2H 系统的基本原理、衍生系统和应用进展等方面进行介绍。

1 酵母双杂交系统的原理

酵母GAL4转录因子由两个可以分开的结构域组成：DNA 结合域（DNA binding domain，BD）负责结合基因的上游激活序列，将转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到启动

收稿日期：2013-08-03基金项目：特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）作者简介：黄欣媛，女，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：huangxycn@

酵母双杂交及其衍生系统

黄欣媛1 范红波2

（1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000；2.湖北职业技术学院，孝感 432000）

摘 要： 酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去20多年里，大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。

关键词： 酵母双杂交系统 蛋白质相互作用 双杂交技术体系

The Yeast Two -Hybrid System and Its Several Derived Systems

Huang Xinyuan 1 Fan Hongbo 2

（1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables ，Hubei Engineering University ，Xiaogan 432000；2.Hubei

Polytechnic Institute ，Xiaogan 432000）

Abstract: The Yeast two -hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein -protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two -hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein -ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques.

Key words: Yeast two -hybrid（Y2H）system Protein -protein interaction Two -hybrid methodology system

子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活基因转录，只有BD 和AD 通过一定方式在空间上足够靠近，才能发挥完整的GAL4转录因子活性。基于此特点，Fields 和Song ［2］设想以一对能相互作用的蛋白质为桥梁，将空间上分开的BD 和AD 彼此拉近，从而重建出具有活性的转录因子，以此创立了Y2H 系统。在该系统中，将BD 和AD 基因分别和诱饵蛋白（Bait）和猎物蛋白（Prey）基因构建成融合蛋白表达载体，使其在酵母中共表达出BD -Bait 和AD -Prey，借助Bait 和Prey 的物理性相互作用使BD 和AD 相互靠近而产生具有功能的转录因子，进而激活1个或多个报告基因（如lacZ 、HIS3和URA3等）的转录。

2 酵母双杂交系统的衍生系统

Y2H 系统是在酵母菌这种真核细胞环境中研究

生物技术通报Biotechnology Bulletin2014年第1期76

蛋白相互作用的一种技术，具有操作简便、无需繁琐的蛋白纯化操作、可以检测较弱的相互作用等优点［3］。但是也存在假阳性率较高（检测到的相互作用有20%-50%在真正生理环境下并不发生［4］）、技术灵敏度较低（一次检测只能涵盖5%-20%的真正相互作用［5］）等缺陷。针对此，很多学者不断改进试验设计和操作技术，开发出许多衍生系统，提高了传统Y2H系统的灵敏度和特异性，极大地扩展了Y2H系统的应用范围。

2.1 筛选模式的多元化

在Vidal等［6］建立的反向双杂交系统（Reverse two-hybrid system）中，使用URA3作为报告基因，其表达产物对酵母菌具有毒性，使其不能生长。当Bait和Prey没有相互作用或互相解离时，毒性报告基因不表达，菌株能正常生长。这种反向筛选（负筛选）法可鉴定出阻断蛋白间相互作用的因子，在研究蛋白质重要结构域和作用位点以及影响蛋白质结合或解离的因素等方面发挥重要作用［7］。

研究蛋白质-DNA相互作用的酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）［8］的原理在于：Prey蛋白可直接与DNA相结合，使得与Prey融合的AD激活报告基因的表达，而无需BD-Bait蛋白参与，故被命名为“单”杂交系统，它为转录因子的分离鉴定研究提供了有效方法［9］。

某些蛋白质的相互作用需要第三个分子如小分子配体、RNA等来介导，三杂交系统（Three-hybrid system）［10］就是研究这些第三分子的技术。第三分子通过对Bait或Prey蛋白进行修饰，或诱导其构象发生改变，从而使两者产生相互作用，进而激活报告基因表达。

双诱饵酵母双杂交系统（Dual bait yeast two-hybrid system）［11］在同一酵母细胞中转入一个AD-Prey和两个不同的BD-Bait，如果一个Bait与Prey 之间有相互作用，则可激活该Bait对应的报告基因的表达，两个Bait都可以和Prey作用的话就会激活所有报告基因。它的优点是仅一次实验就能同时进行两次独立筛选，并可比较出这两对蛋白结合能力的差异。该系统被成功地应用于研究靶蛋白上的作用位点，以及药物对蛋白互作的破坏作用［12］。2.2 报告基因的改进

多个报告基因的引入有利于提高Y2H技术的灵敏度和选择性，如广泛应用的PJ69-4A酵母菌株［13］包含HIS3、ADE2和lacZ三个报告基因。Shaffer等［14］以此酵母菌为基础，改造成BAPJ69-4A菌株，加入URA3作为第4个报告基因，使得基于该菌株的Y2H既可用于正筛选，也可用于负筛选。

lacZ报告基因的转录主要靠定性或定量的β-半乳糖苷酶活性分析来检测，需要使用发色底物X-Gal，而荧光蛋白作为报告蛋白的优点在于不需要添加额外的底物，可以通过流式细胞术直接检测并分离出阳性细胞，无需繁琐的选择性培养基筛选操作。如Chen等［15］将酵母加强绿色荧光蛋白（Yeast enhanced green fluorescent protein，yEGFP）基因、Da-mon等［16］将加强黄色荧光蛋白（Enhanced yellow fluorescent protein，eYFP）基因作为报告基因引入Y2H系统，可用荧光显微镜观察报告蛋白的表达，并可方便地应用流式细胞仪来鉴定筛选蛋白质相互作用［17］。

2.3 载体构建策略的改进

在表达载体构建上的一些改进措施可以降低Y2H系统的假阳性和假阴性率。传统Y2H系统中构建的融合表达载体是将Bait或Prey蛋白与BD或AD的N端融合，Stellberger等［18］设计了两个新载体：pGBKCg和pGADCg，分别用于将BD的C端和Bait，以及AD的C端和Prey蛋白融合。在Y2H筛选中，将这两个载体和已有的两种N端融合载体联用，可形成4种不同的Bait-Prey作用组合，即NN、NC、CC和CN。经过对水痘带状疱疹病毒的70种蛋白质组合成的约4 900个候选作用配对进行测试发现，综合使用4种载体组合所筛选到相互作用是传统Y2H使用单一NN组合的两倍，显著降低了假阴性率。此外，各组合得到的相互作用结果还可以互相印证，进一步削减了假阳性率［19］。

2.4 宿主系统的扩展

细菌双杂交和哺乳动物双杂交的出现将Y2H 的宿主由酵母细胞扩展到细菌和哺乳动物细胞内。细菌双杂交系统（Bacteria two-hybrid system）由Karimova等［20］设计，利用腺苷酸环化酶缺陷型大