原创紫外分光光度法应用讲座-1
紫外可见分光光度法基本原理PPT讲稿
E=h=hc/
（Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的 电子光谱。
讨论：
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的 能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性 的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关， 也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩 尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比， 这是定量分析的依据。
* σ σ* (150~210nm)
H
* n σ* (259nm)
HCI
H
（2）不饱和脂肪烃
• 这类化合物有孤立双键的烯烃(如乙烯)和共轭双键的烯
烃(如丁二烯)，它们含有π键电子，吸收能量后产生
π→π*跃迁。乙烯(孤立双键)的
m
a
为171nm(
x
＝
15530 L mol1 cm1 )；而丁二烯H(2C CH CH CH2 )
列吸收带，称为精细结构吸收带，亦称为B吸收带[从德文 Benzenoid(苯的)得名]，这是由于跃迁和苯环的振动的重叠引起的。B 吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。 苯环与生色团连结时，有B和K两种吸收带，有时还有R吸收带，其中 R吸收带的波长最长 。
生色团与助色团
生色团(Chromophore)： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生
分光光度法专题知识专业知识讲座
邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线
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（1）同一种物当质之处对，不请联同系波本长人或光网的站删吸除光。度不同。吸光 度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax
吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多。
二．光的吸收定律 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不 当之处，请联系本人或网站删除。 (Lambert-Beer定律)
1760 年， Lambert 指出：一束平行单色光通过有色吸溶 液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。
物质对光的当之吸处收，请曲联系线本人或网站删除。
某一溶液对何种波长的光吸收？吸收的程度如 何？
这可通过使不同波长的光通过某一固定浓度 的有色溶液，分别测量每一波长下对应的光的 吸收程度[吸光度， A]， 作A-λ曲线，即吸收光谱曲线。
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互补色光 当之处，请联系本人或网站删除。紫红 Nhomakorabea橙
蓝
白光
黄
青蓝
绿 青
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物质对光的选当之择处，性请联吸系本收人或网站删除。
物质的颜色：
• 在可见光区(400~760nm)不同波长的光具有不同的颜色。 • 溶液呈现一定的颜色是对光选择性吸收的结果。当一束白光
肉眼可感受到的光
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紫外可见分光光度法培训课件[可修改版ppt]
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有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基 团（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、NR2 ）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这 种效应称为红移效应。在某些生色团如羰基的碳原 子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短 波方向移动，这种效应称为蓝移效应。如-CH2、CH2CH3、-OCOCH3。
g -X-射线
紫外 可见
红外
微波 无线电
真空紫外
近红外
核磁共振
波长越短，能量越高
二、紫外可见光谱
紫外吸收光谱：电子跃迁光谱
吸收光波长范围200400 nm（近紫外区） ，可用于 结构鉴定和定量分析。
可见吸收光谱：电子跃迁光谱
吸收光波长范围400780 nm ，主要用于有色物质的定量分析。
特点
灵敏度高 准确度较好 操作简单
max
H2O
167
CH3OH
184
CH3Cl
173
(CH3)2O
184
1480 150 200 2520
* 和 n * 跃迁
• * 和 n * 跃迁能量低（>200 nm）
• 含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁
C=C; C=C ; N=N ; C=O
• 有机化合物的紫外-可见吸收光谱分析多以这两 类跃迁为基础
16
紫外光谱中常用的术语
红移—λmax向长波方向移动
蓝移— 向短波方向移动 增色效应—吸收强度即摩尔吸光
系数 ，ε增大的现象
减色效应—吸收强度即摩尔吸光 系数， ε减小的现象
引入取代基或改变溶剂
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无机化合物的紫外—可见吸收光谱
紫外分光光度法的应用讲课文档
1/27/2022
第11页，共34页。
五、偏离光的吸收定律原因
朗伯-比尔定律：A=k C L
依据Beer定律，A与C关系应为 经过原点的直线
偏离Beer定律的主要因素表现为
以下两个方面：
（一）化学因素
（二）光学因素
第12页，共34页。
（一）化学因素
朗—比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；
色散元件
棱镜
光栅
对不同波长的 光折射率不同
玻璃棱镜:适用于可见区 石英棱镜:适用于紫外区
衍射和干涉,不同波长 的投射方向不同
高度抛光的玻璃上刻有等 宽、等距平行条痕
3.吸收池：比色皿、比色杯，装样品溶液。有玻璃、石英杯两种
4.检测器：光→电，光电池(硒,硅)，光电管(红,紫)，光电倍增管。 5.信号处理显示器：放大较弱的电信号，并在检流计上显示出来。
紫外分光光度法的应用第1页 Nhomakorabea共34页。
（优选）紫外分光光度法的应 用
第2页，共34页。
物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。
即物质的颜色是它所吸收光的互补色。
物质的本色
无色溶液：透过所有颜色的光
有色溶液：透过光的颜色 黑色： 吸收所有颜色的光 白色： 反射所有颜色的光
第3页，共34页。
T = 0.0 % ： 光全吸收 T = 100.0 % ：光全透过
显然，T↑，溶液吸收度↓；T ↓，溶液吸收度↑。 即透光率T反映溶液对光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。
②吸光度（吸收度）A
定义： A = lg
1 T
I0 = -lgT = lg It
A=-lgT , T=10-A
分析化学系列课件 紫外-可见分光光度法学习课件(PPT课件)
红移(red shift) 长移(bathochromic shift)
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增色效应或浓色效应 (hyperchromic effect)
返回
example
11.1.3 吸收带及其与分子结构的关系
吸收带 特 点 波长较长 弱吸收 λ(nm) ~300
吸收强度 (max)
+ + +
C
–
+ +
–
C
+ +
–
*
+
–
+
C C
–
+
+
C
–
+
+
C C
*
+
C
–
上一内容 下一内容
–
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–
返回
共轭双键的离域作用
４ * ３
* 最高空轨道
E>E →跃迁几率↑→↑ ； E↓→↑ 最低占有轨道 ２ １ C=C 共轭 C=C
上一内容
下一内容
• 吸收光谱的特征 • 生色团和助色团 • 红移与蓝(紫)移 • 增色效应和减色效应 强带(strong band) max>104 • 强带和弱带 弱带(weak band) max<102
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吸收光谱(absorption spectrum)的特征
X 微 红 可 紫 射 波 外 见 外 线 400~760nm 200~400nm
γ 射 线
3×1010 3×1012 3×1014 3×1016 3×1018 3×1020 3×1022
中国药典版紫外分光光度法讲义(1)课件
中国药典版紫外分光光度法讲义(1)
8
• 二、Beer-lambere定律，它是描述物质对 单色光吸收强弱与吸光物质的厚度和浓度 间关系的定律。
• 数学表达式为A=ELC A为吸光度，吸光 度与浓度或厚度之间是正比关系，其中E是 比例常数，称为吸光系数。
中国药典版紫外分光光度法讲义(1)
18
• 比值
• 有时也会用峰谷吸收度的比值控制杂质限量。例 如，碘磷定有很多杂质，如顺式异构体、中间体 等，在碘磷定的最大吸收波长294nm处，这些杂 质无吸收，但在262nm碘磷定的吸收谷处有吸收， 则可利用碘磷定的峰谷吸光度的比值作为杂质限 量检查指标，已知纯品碘磷定的A294/A262＝ 3.39，如果在262nm
• （摩尔吸光系数的意义是在一定的波长下，溶液浓度为1mol/L厚度为 1cm时的吸光度。百分吸光系数，又称比吸光系数，只在一定波长下， 溶液浓度为1％（W/V）厚度为1cm时的吸光度。）
中国药典版紫外分光光度法讲义(1)
14
• 对比吸光度比值的一致性
• 有时物质的吸收峰较多，可规定在几个吸收峰处 吸光度或吸光系数的比值作为鉴别标准。（比如 维生素B12注射液的鉴别，规定应在361nm与 550nm的波长处有最大吸收；361nm波长处的吸 光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.15～ 3.45）。
如果两种纯化合物的紫外光谱明显差别时，则可以肯定两 种化合物不是同一物质。
• 对比吸收光谱特征数据的一致性
中国药典版紫外分光光度法讲义(1)
12
• 最常用于鉴别的光谱特征数据有吸收峰（λmax） 和峰值吸光系数（εmax或E1%1cm），这是因为 峰值吸光系数大，测定灵敏度较高，且吸收峰处 与相邻的波长处吸光系数值的变化较小，测量吸 光度时受波长变动影响较小，可减少误差。不只1 个吸收峰的化合物，可同时用几个峰值做鉴别依 据。（如药检所去年以来检的创可贴，就是在 257nm、262nm、269nm三个波长处测定最大吸 收，规定三个波长处都应有最大吸收，没有最大 吸收就可以判定为假药）。
紫外——可见分光光度法教学课件PPT
KMnO4
530nm
AB 2
B 2
cBL
B 2cA B B 2 L 1 1 0 0 .4 2 4 1 4 2 0 0 L m o l 1c m 1
在 T = 36.8%(A=0.434)时，浓 度测定的相对误差最小。 在 实际测定时，常将吸光度控 制在0.2 ~ 0.7(T=20% ~65%) 之间。
测定相对误差与透光率的关系
3、参比溶液的选择
样
未考虑吸收池和溶剂对光
品
子的作用
参
I0
比
原则:使试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。
利用空白试验来消除因溶剂或器皿对入射光反射和吸收带 来的误差。
例：用光程为1cm的吸收池，在两个测定波长处测定含有
K2Cr2O7和KMnO4两种物质溶液的吸光度。混合物在 450nm处的吸光度为0.38，在530nm处的吸光度为0.71，求 混合物的组成。已知1.010-3 mol/L的K2Cr2O7 在450nm处 吸光度为0.20，而在530nm处为0.05； 1.0 10-4mol/L的 KMnO4在450nm处无吸收，在530nm处吸光度为0.42。
c5 2..0 0 0 5 1 1 6 3 0 0 L g5 .0 0 1 （ 4 0gL 1)
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
a b A c 2 .0 c m 5 .0 0 .3 1 0 0 4 g 0 0 L 1 3 .1 0 -2 L 0 0 - 1 .c .g 1 m
Fe(SCN)3
Fe3+ + 3SCN－
溶液稀释时一倍时，上述平衡向右，离解度增大。所以
Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致 偏离朗伯—比尔定律。
紫外可见分光光度PPT(完整版)课件
2023/10/14
10
Wavelength
2023/10/14
11
て
~104 10～100 100～300
k
~200 200～800
<200 ~150(<200)
Amax(nm)
<U<M<M<xD<U<*0<1<*1<0<*0<0
(red shift 或bathochromic
shift) 指取代基或溶剂效应引起吸收带 向长波方向的移动；
蓝移 ( blue shift 或 hypsochron sh ift) 或紫移： 吸收带向短
波方向移动
2023/10/14
16
常见助色团及其助色效应(红移)λ
-F<-Cl<-Br<-OH<-OCH₃<-N NHCH₃<-N(CH₃)₂<-NHC₆H₅<
6
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
2023/10/14
不是任一波长的 光都可以被某一物质 所吸收，由于不同物 质的分子其组成结构 不同，它们所具有的 特征能级也不同，故 能级差不同，而各物 质只能吸收与它们内 部能级差相当的光辐 射，所以，不同物质 对不同波长的光吸收 具有选择性。
7
物质颜色与光吸收的关系
2023/10/14
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四、 无机化合物的吸收光谱
金属离子 金属离子
配位体
d-d配位场跃迁
配位体
配位体π- π*
金属离子
配位体
电荷转移
2023/10/14
紫外可见分光光度法(共73张PPT)
2022/11/21
分光光度计的类型
2022/11/21
3.紫外-可见吸收光谱及其特征
吸收光谱
用不同波长的紫外-可见光（200~ 760 nm）依次照一定浓度的被测样品溶液时，就 会发现部分波长的光被吸收。如果以波长λ为 横座标（单位nm），吸收度 （absorbance）A为纵座标作图，即得到紫 外-可见吸收光谱（ultraviolet-visible spectra，简称UV）。
对光波来说，产生感光作用与生理作用的是 电场强度 E 。
2022/11/21
光的波长越短（频率越高），其能量越 大。
紫外光区 可见光区
远紫外区 10-200 nm （真空紫外区）
近紫外区 200 - 400 nm （UV光谱的研究区域）
400 - 760 nm
2022/11/21
2022/11/21
能量最小，λ 200~400nm（近紫外区）
ε = 10~ 100，弱吸收
跃迁能量大小： σ→σ* > n→σ* > π→π* > n→π*
2022/11/21
∆E
n → σ*
σ→ σ*
π → π* n → π*
200
300
σ*反键轨道 π*反键轨道
n 非键轨道 π 成键轨道 σ 成键轨道
λ（nm）
第二节 紫外-可见分光度计
紫外-可见分 光光度计
2022/11/21
一、分光光度计的主要部件
Major Components of spectrometer
紫外-可见分光光度计的基本组成模块（ general process）
2022/11/21
1.光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连 续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、 较长的使用寿命。
紫外-可见分光光度法——(最终版)PPT演示课件
第十章 紫外-可见分光光度法
电子跃迁类型
1、※σ→σ*跃迁 跃迁所需能量最大 λ<150nm ε＞104 饱和烃（远紫外区） C-H共价键，如CH4（ λmax 125nm） C-C键，如 C2H6 (λmax 135nm)
仪器分析
第十章 紫外-可见分光光度法
电子跃迁类型
2、π→π*跃迁 跃迁所需能量较大
T,
T A
C
三
者
0.5
的
关
系
0
c
100
T = 0.0 %
A=∞
50
T = 100.0 %
A = 0.0
0
溶液的T越大,说明对光的吸收越小,浓度低; T越小，溶液对光的吸收越大，浓度高
第十章 紫外-可见分光光度法
仪器分析
吸光度的加合性
在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作 用这时体系总的吸光度等于各个吸光物质的吸 光度之和。
仪器分析
2.※百分吸光系数：在一定波长下，
溶液中吸光物质浓度为1%（W/V），液
层厚度为1cm的吸光度。用 E1% 表示， 1cm
单位：ml/cm·g。
将两者之间的转换关系用公式来表达
M E1%
10 1cm
第十章 紫外-可见分光光度法
仪器分析
※摩尔吸光系数ε 的讨论
（1）吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
大部分在远紫外区
含非键电子饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原
子)
一氯甲烷 n→σ*跃迁：λmax 173nm 甲醇 n→σ*跃迁：λmax 183nm
第十章 紫外-可见分光光度法
电子跃迁类型
4、n→ π*跃迁
新紫外分光光度计的使用原理和方法精品PPT课件
I0= Ia+ It
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透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示：
即 T= It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即
A=lg1/T=lgI0/It
20
二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
3. pH值
15
1.5 紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量
分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、 结构分析。 1.定性分析
16
2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方
便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用
A280/A260的比值，鉴定其纯度。
17
2. d电子跃迁吸收光谱 过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨 道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰 强烈受配位环境的影响。
例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm 处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此 类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。
12
3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给 体，又是电子受体，当电子受辐射能激发 从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生 较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。 如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。
紫外分光光度计的使用原理和方法
紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法 在医学检验中的应用
1
紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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一定性分析判断异构体：紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。
共轭体系越大，吸收强度越大，波长红移。
如：和前者有紫外吸收，后者的lmax<200nm。
同样，CH 3COCH2CH2COCH3的最大吸收波长要短于CH3CH2CO-CO CH2CH3。
下面两个酮式和烯醇式异构体中，烯醇式结构的摩尔吸光系数要远大于酮式，也是由于烯醇式结构中有双键共轭之故。
CH2COCH2COOC2H5CH3C(OH)=CHCOOC2H5酮式(lmax =275 nm, e =100) 烯醇式(lmax =24 5 nm, e =18,000)判断共轭状态：可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。
如二苯乙烯（ph-CH=CH-ph）顺式比反式不易共平面，因此反式结构的最大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式。
顺式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,000已知化合物的验证：与标准谱图比对，紫外-可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段。
[原创]紫外分光光度法应用讲座-2单组分定量分析紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。
尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。
其用于定量分析的优点是：可用于无机及有机体系。
一般可检测10-4-10-5 mol/l的微量组分，通过某些特殊方法(如胶束增溶)可检测 10-6-10-7 mol/l的组分。
准确度高，一般相对误差1-3%，有时可降至百分之零点几。
2.1 分析条件的选择2.1.1 溶剂的选择2.1.2测定浓度的选择2.1.3 测定波长的选择2.2定量分析方法2.2.1 标准曲线法2.2.2 标准加入法接下来咱们分别看一下:2.1.1溶剂的选择所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。
下表为某些常见溶剂可用于测定的最短波长。
2.1.2浓度的选择溶液吸光度值在0.2-0.8范围内误差小(A=0.434时误差最小)，因此可根据样品的摩尔吸光系数确定最佳浓度。
根据吸收定律， (方程1, 2, 3)要使测定浓度的相对误差最小，应满足条件 (1)即吸光度A=0.4343时，吸光度测量误差最小。
(方程1，2，3及要满足的条件1见下一帖)2.1.3波长的选择一般选择最大吸收波长以获得高的灵敏度及测定精度。
但所选择的测定波长下其他组分不应有吸收，否则需选择其他吸收峰。
2.2.1标准曲线法配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。
通过标准曲线可求得未知样品的浓度。
2.2.2标准加入法样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。
将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0, C1, C2…, Cn的待测组分配制溶液。
由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。
若直线通过原点，则样品中不含待测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。
这一讲就到这里,下一讲我们讲"混合物分析"[原创]紫外分光光度法应用讲座-3混合物分析根据吸光度的加和性，测定混合物中n个组分的浓度，可在n个不同波长处测量n个吸光度值，列出n个方程组成的联立方程组。
如三组分体系：A 1=e11C 1 +e12C 2+e13C 3A 2=e21C 1+e22C 2+e23C 3A 3=e31C 1+e32C 2+e33C 3式中e ij为在波长i测定组分j的摩尔吸收系数，A i为在波长i测得的该体系的总吸光度，C j为第j组分的浓度。
上述方程组的解为Cj=Dj/D, j=1, 2, 3 式中e11 e12 e13D = e21 e22 e23e31 e32 e33A1 e12 e13D 1= A2 e22 e23A3 e32 e33e11 A1 e13D 2= e21 A2 e23e31 A3 e33e11 e12 A1D 3= e21 e22 A2e31 e32 A3方法的关键是选择合适的测定波长。
在某一测定波长下其他组分的贡献要小。
分别测定纯组分1，2，3及混合物的吸收光谱，可得A1, A2, A3, e11, e12, e13, e21, e22, e23, e31, e32, e33。
在下一讲我们将讲到如何用紫外法进行平衡常数的测定.[原创]紫外分光光度法应用讲座-4平衡常数的测定在化学平衡研究、分子识别中常常需要测定酸解离常数、pH值、氢键结合度等等。
设均一水溶液中酸解离及其与金属的络合平衡如下：(1)(2)(3) (4)由物料平衡，[(HL) t]=[HL]+[MHL]+[L-]+[ML]=[HL t]+[L t] (5)[HL t]=[HL]+[MHL]=[HL](1+K MHL[M+1)(6)[L t]= [L -]+[ML]=[L - ](1+K ML[M +])(7)由(1), (5), (6), (7)式得：(8)只考虑酸解离型体的吸收时，酸解离引起的吸光度增加∆A L=A-A un=εL - [ L - ]+ε ML [ML ]= [L - ](ε L-+ εML K ML[M+])=B [L-] (9)A un为低pH下酸性型体HL, MHL的吸收，为一常数。
根据(8), (9)式，得(10)由此得到(11)因此，以[H+]DAL对DAL作图得直线，从直线斜率可求得表观酸解离常数Ka app：(12)若不加金属离子，只存在酸解离平衡时，(11)式简化为：(13)从直线斜率可直接求得Ka。
这一讲到此结束,下一讲我们将讲到"络合物结合比的测定".再见.紫外分光光度法应用讲座-5络合物结合比的测定通过紫外-可见吸收光谱的测定，可以求得主客体络合物的结合比。
常用以下几种方法。
1.摩尔比法2.连续变换法或Job法3.斜率比法4.B-H方程(Benesi-Hildbrand Method)下面我们来讲一下.1.摩尔比法设有络合反应mM + nY = MmYn，固定一个组分(如M)的浓度不变，改变另一组分(如Y)的浓度，求得一系列[Y]/[M]比，在络合物MmYn的最大吸收波长处测定吸光度的变化。
则开始时，随[Y]/[M]的增加，溶液吸光度线性增加，到达络合物的组成比后，继续增加[Y]/[M]，会有三种不同情况：吸光度达到饱和，不再增加。
说明试剂Y无吸收，吸光度的增加只是络合物的单独贡献。
如Fe(III)-钛铁试剂络合物。
吸光度出现一转折点后继续增加。
说明试剂Y在络合物的lmax处稍有吸收。
如Zn-PAN络合物。
PAN：1 -(2-吡啶基偶氮)-2-萘酚。
吸光度出现一转折点后呈直线下降。
说明分步生成了摩尔吸光系数小于络合物e的高次络合物。
如Bi-二甲酚橙络合物。
2.连续变换法或Job法保持金属离子M和络合剂Y的总摩尔数不变，连续改变两组分的比例，并逐一测定体系的吸光度A。
以A 对摩尔分数fY= [Y]/([M]+[Y])或fM=[M]/([M]+[Y])作图，曲线拐点即为络合物的组成比。
但此法对n/m > 4的体系不适用。
3.斜率比法配制两个系列的溶液，其一是络合剂的初始浓度[Y]0保持过量且恒定，改变金属离子M的浓度形成络合物MmYn，测定相应溶液的吸光度，以A对[M]作图得直线1；另一系列是使金属离子的初始浓度[M]0保持过量且恒定，改变络合剂Y的浓度形成络合物MmYn，测相应的吸光度，以 A对[Y]作图得直线2。
两直线的斜率分别是SM和SY。
则：[Y]0过量时，平衡状态下，[M]= [M]0-m[MmYn]=0，A=eb[MmYn]= eb [M] 0/m (1)A对[M]0作图时直线斜率为SM=eb /m(2)[M]过量时，平衡状态下，[Y]= [Y]0-n[MmYn]=0，A=eb[MmYn]= eb [Y] 0/n (3)A对[Y]0作图时直线斜率为SY=eb/n(4)则n/m=SM/SY(5)这一讲此结束,至于"4.B-H方程(Benesi-Hildbrand Method) "由于内容较多,我们放在下一次讲.再见[原创]紫外分光光度法应用讲座-64.B-H方程(Benesi-Hildbrand Method若络合反应、酸碱反应、二聚体生成、主-客体反应等可用反应物A(分析浓度CA)与反应物B(分析浓度CB)按1:1生成C(平衡浓度)表示，则平衡常数:(1)以光路长为b cm的吸收池测定该溶液的吸收光谱，波长l下测得的吸光度为D。
各组分的摩尔吸光系数分别以, , 表示时，(2)令:(3)(4)则:(5) 因此:(6)(7)(8)代入(1)，得：(9) 若组分B在l处几乎无吸收(e B=0)，使加入的B组分大大过量(C B>>C A)，则(9)式简化为：(10)变形后得：(11) (11)式称扩充的Benesi-Hildbrand方程。
固定组分A的分析浓度，改变组分B的分析浓度并测定相应的吸光度，以C A/(d- d 0)对1/ C B作图得一直线。
由直线斜率及截距可求得K。
但上式只在C B>>C A或K值较大时成立。
若A和B都无吸收，则(11)式可简化为：(12)(12)式称Benesi-Hildbrand方程。
Benesi-Hildbrand方程也适合用荧光法、核磁共振法测定平衡常数。
本来该课程到此结束语,可是后面"分子荧光、磷光和化学发光"内容不太多,就在下一次再讲一次吧.[原创]紫外分光光度法应用讲座-7分子荧光、磷光和化学发光这一节本不属于紫外法应用的内容,不过我还是在此讲一下吧,内容不多.荧光、磷光和化学发光分析统称为发光分析(lumines cence)。
荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，又称光致发光分析(photolu minescence)。
发光分析具有如下特点：灵敏度高。
检测限比吸收光谱法低1-3个数量级。
通常在ppb级。
发光参数多，可进行动力学分析。
而吸收光谱法只能研究基态分子的反应。
分析线性范围比吸收光谱法宽许多。
选择性比吸收光谱法好。
能产生紫外-可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光。
由于能进行发光分析的体系有限，故应用范围不及吸收光谱法广。
但采用探针技术可大大拓宽发光分析的应用范围。
具体内容大家可参考其它的专业书.至此关于紫外的应用就告一段落了,再见。