各突变检测方法比较

1、RNA酶A切割法（RNase A cleavage）

在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA 切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。

电泳法（不能确定突变位点，都要通过测序等解决）

2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）

双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有GC 夹子的DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。

3、 PCR-SSCP法单链构象多态性

单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)是一种分离核酸的技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸（性质类似于DGGE和TGGE，但方法不同）。

实验步骤

利用PCR从提取出的DNA中扩增16S rRNA基因。

利用λ-外切核酸酶消化掉一条链（其中一个PCR引物被磷酸化，这条链将被去除）。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。

应用：单链构象多态性可用于预筛选克隆文库。

可对其中的某一个条带进行测序，并与数据库中已知序列比对。

原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使是一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。

4、杂合双链分析法(HA)

由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电

泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率,从而使两者被分离开。该方法原理与单链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链,而HA法分离的是双链。HA法简单迅速,但只适用于200～300pb的片段,且不能确定突变位置,检出率只有80%左右,有人建议将HA 法和SSCP法联合使用,可能将检出率提高到接近100%,也有科研工作者建议使用缺失的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度。

5、化学切割错配(CCM)

化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmiumtetroxide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变。只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞。该方法的最大优点是能对长至2kb的片段分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。

6、碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)

与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰,当用标记的引物对CDI修饰过的双链DNA进行DNA合成时,延伸会在修饰过的碱基处终止下来,合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测出是否有突变。该方法的最大优点也是能对1～2kb的片段进行分析,突变检出率达到100%,能确定突变位置,并且CDI是一种没有毒性的物质,有报道曾用该法检测出了

7.2kbDNA片段中的一个点突变,但当一个DNA片段中存在多个突变时,该方法就不适用。

7、酶促切割错配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)

EMC是一种与RNaseA切割相类似的方法。

T4核酸内切酶是一种分解酶(resolvase),能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附近进行切割，酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变，电泳产物的检测可用放射自显影，也可用银染。由于该法能对DNA∶DNA异源杂合分子进行分析，因而省去了体外转录的步骤，其最长检测片段可达到1.5kb，该法的缺点是存在非特异性切割现象，并且对有些错配碱基的识别不是100%，因此在每次检测时都必须设有一个内对照。

8、限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism , RFLP)连琐分析技术

RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

RFLP技术主要包括以下基本步骤：

DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。

其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。

发展：反向限制性位点突变分析（iRSM），进行低突变频率等位基因的检测。其方法主