葡萄汁和葡萄酒微生物分析(微生物的监测、分类和计数)国际标准
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殖，并形成肉眼可见的菌落。 3.1.1 平板培养 目的 平板培养适宜于微生物浓度比较高，需稀释后计数的样品。 用具 除以上所列出的用具外，还需要57cm2的培养皿(塑料)或65cm2的培养皿 ［派热克斯(Pyrex)玻璃］。 缓冲液(稀释液)和固体培养基(见附件4和5)。 操作 将微生物接种到培养基中或培养基的表面，经过一定时间培养后，培养皿中直接 计数。 稀释 由于事先不知道样品中的微生物数量，所以，样品的稀释应该逐渐进行，每次稀 释十倍，以便获得适合菌落计数和鉴别的微生物数量(30-300个菌落)。为了确定稀释倍 数，可先用显微镜进行观测。将样品摇匀后，用稀释液制备一系列的十倍(1∶10)的稀 释样。具体操作如下。 取1ml样品和9ml稀释液装入第一个试管中，摇匀。取1ml第一个试管的稀释样和 9ml稀释液装入第二个试管中。依次继续进行，直到最后一个试管具有合适的浓度。每 次稀释时，都应用无菌吸管(具体操作见附件1的简图)。 倾注式接种 每个培养皿中的菌落数最好在30-300之间。 取1ml样品和1ml每个稀释样，接入相应的两个培养皿立即摇匀。取样时，应使用 相应的无菌吸管。然后，注入15ml42℃-45℃的事先在水浴中溶解的相应的琼脂培养 基，立即轻轻地摇匀，并防止产生气泡和溢出培养皿。将接种后的培养皿放在平面 上，使之凝固。 涂布接种 取0.1ml-0.2ml的稀释样，接种到琼脂培养基的表面，并防止表面上的液体过多。 用经酒精和火焰灭菌后的玻璃棒，将接种液均匀地涂在培养基的表面。 将接种后的培养皿倒置在培养箱中进行培养： 酵母菌，20℃-25℃，在有氧条件下培养3-10天〔对酵母菌计数，一般情况下培养3 天就足够了，但是，如果怀疑有Dekkera 酒香酵母(Dekkera Brettanomyces)，则应培养710天〕； 乳酸菌，25℃，在无氧条件下培养4-10天； 醋酸菌，25℃-30℃，在有氧条件下培养2-4天。 然后用肉眼或使用放大镜计数形成的菌落数。如果有疑问，可用显微镜对菌落进 行鉴定。 在每次试验中，都应用无菌水对培养基、稀释液和用具进行空白试验，以检验它 们的无菌性。 结果 结果的表述为菌落单位/ml(UFC/ml)(因为每一个菌落可能是由一个或一群微生物 细胞形成的)，而且应用10n表示(如1100应表述为1.1×103UFC/ml)。 如果菌落数为估计计算数，则结果应表述为UFCE/ml。 计数应选择菌落数在30-300个的培养皿进行。 计算菌落单位时，先计算所涉及到的菌落的平均值，然后再乘以稀释倍数。 标出培养天数。
3.微生物的培养计数
目的 微生物培养计数的目的是，鉴定样品的微生物感染的可能性，即预测它的 微生物稳定性，因为只有活的微生物才能感染葡萄酒。根据所用的培养基和培养条件 不同，我们可以对酵母菌、乳酸菌和醋酸菌三种微生物进行计数。 3.1 固体培养 原理 将活的微生物植入选择培养基，并在适宜的条件下培养，微生物就会繁
2.微生物检测、鉴定和酵母菌直接计数
2.1 液体或沉淀物的镜检 目的 直接镜检是为了观测、区分可能存在的酵母菌和细菌。但是，直接镜检并 不能区分死、活微生物。 备注 使用活体染色法，可检测活酵母菌数。 原理 利用显微镜的放大原理，可观测到大小只有以微米计的微生物。 操作 可以直接用液体或沉淀物在显微镜下观测。但液体直接镜检只有当其微生 物群体数量足够大(＞5×105)个细胞/ml)才有效。 如果葡萄酒中的微生物群体量较低，则应通过离心浓缩后再镜检：取10ml摇匀的 酒样，用3000-5000转/分离心5-15分钟，去除上清液，将沉淀与剩余的酒样摇匀后镜 检。
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镜检：用经消毒的吸管取一滴液体或摇匀后的沉淀物置于一干净的载玻片上，盖 上盖玻片，用显微镜观察。计数时应选取5个不同的视野计数，然后用每立方厘米含有 的细胞数表示。如果细胞数量太多，则应进行稀释。放大倍数通常为400-1000。 2.2 甲基蓝活体染色 目的 区分活酵母和死细胞。 原理 活细胞中的酶可使染料还原。例如，生活细胞可将甲基蓝还原成隐色化合 物而为无色，死细胞则吸附色素而变为蓝色。 试剂 0.1%甲基蓝溶液。制备：取0.1g甲基蓝在三角瓶中用100ml蒸馏水溶解后即 可。甲基蓝溶液必须为新配制的。 操作 取一滴样品和一滴甲基蓝溶液置于载玻片上，用接种环(针)混匀，5分钟后 在显微镜下直接观察。 结果 活细胞无色，死细胞为蓝色。 备注 该染色法并不可靠，只能用于粗略计数，不推荐将它用于细菌。为了区分 微生物(特别是酵母菌和细菌)最好使用如荧光显微技术等更为可靠的方法。 2.3 革兰氏染色法 目的 革兰氏染色的目的是为了区分乳酸菌(革兰氏阳性)和醋酸菌(革兰氏阴性)， 并观测它们的形态。 备注 革兰氏染色并不是绝对的，因为除了乳酸菌和醋酸菌外，还可能存在其它 的细菌。 原理 革兰氏染色法是建立在由于革兰氏阴性和阳性细菌间细胞壁结构及化学成 分的不同所引起的差异上的。革兰氏阴性菌的细胞壁富含类脂质，而肽聚糖含量很 少，酒精可穿过细胞壁，溶解结晶紫碘液，使细胞保持无色。相反，革兰氏阳性菌细 胞的细胞壁含有大量的肽聚糖，脂肪含量则很少；因此，肽聚糖的厚度及酒精对它的 水解使酒精不能进入细胞，从而使细胞保持由结晶紫碘液染成的紫色或深蓝色。 革兰氏染色技术有几种不同的变化。如果细菌的培养时间过长，则革兰氏染色法 会失去其精确性。因此，用于染色的细菌应在其对数生长期，即培养24-48小时。 试剂 所用的水必须是蒸馏水。 1)结晶紫溶液 制备：称取2g结晶紫，在100ml三角瓶中用20ml95%的酒精溶解。 在80ml蒸馏水溶解0.8g草酸铵，混合以上两种溶液，24小时后使用。在使用时用滤纸过 滤，在深色瓶中避光贮藏。 2)路哥氏(LUGOL)碘液 制备：在少量水(4-5)ml中溶解2g碘化钾，然后再溶解1g 碘片，定容至300ml。在深色瓶中避光贮藏。 3)复染液(蕃红染色液) 制备：在100ml的三角瓶中，先用10ml的95%酒精溶解0.5g 蕃红，再加入90ml的水。搅拌后，在深色瓶中避光贮藏。 操作 标本涂片的制备：将细菌接种在固体或液体培养基上。如是液体培养，则用离心 收取新鲜培养的沉淀物，或用接种针或接种环直接从固体培养基上取出细菌，并在一 滴无菌水中混 匀。 取一滴细菌悬浮物平摊在载玻片上以制备标本涂片。晾干后，在火焰上迅速通过3 次使之固定。冷却后，进行染色。 染色：在已固定的标本涂片上滴几滴结晶紫溶液，反应2分钟后用水冲洗。 滴1-2滴路哥氏碘溶液，反应30秒后用水冲洗，并用滤纸吸干。 滴几滴蕃红复染液，反应10秒钟后用水冲洗，并用滤纸吸干。
显微镜；精度为±0.1的pH仪；离心机；水浴锅；酒精灯；电炉；精度为0.1mg的 天平；血球计数板；载玻片；盖玻片；滤纸；油浸物镜用油(香柏油)；本生灯；70%和 95%的酒精。 除菌膜过滤设施：微孔滤膜，直径13mm或25mm，孔径0.22μm；平底漏斗；抽滤 瓶；真空泵等。 100ml和1000ml容量瓶；5、100、300、500、1000ml移液管(或量筒)；经消毒的1、 10、15、20和25ml吸管；经消毒的离心管； 备注：亦可使用等效的其它设备。
试剂 3%双氧水：取10ml30%的双氧水，用新鲜制备的蒸馏水定容至100ml，摇匀 后装入深色瓶在冰箱中储备用。3%的双氧水溶液必须在使用前新鲜配制。 操作 滴一滴3%的双氧水在载玻片上，并植入一点新鲜的菌落。如果有气体释 放，则表明该菌含有氧化酶。但是，由于很难直接观测到气体的释放，建议最好在10 倍的显微镜下观测。 2.5 酵母菌的直接计数 目的 观测酵母菌的群体数量(包括活细胞和死细胞) 备注 此项技术只实用于酵母菌的计数，对于细菌，由于其个体太小和胶体离子 的影响，而不能直接计数。在此情况下，可用甲基蓝染色法粗略观测细菌活细胞的数 量。 原理 用已知容量的样品直接在显微镜下观测计数。所需设备为特殊的细胞计数 载玻片。 备注 载玻片与盖玻片一起可容纳已知量的样品。但是，计数板具有不同的种 类。例如，血球计数板的面积为1mm2，深度为0.1mm，而且被均分为400个小方格，所 以每个方格中所含有的样品量为1/400mm3。 操作 取一滴摇匀的样品置于载玻片的计数板中，盖上盖玻片，并防止计数板中产生气 泡。静止几分钟以固定样品。 但是，样品的浓度不能太大或太小。浓度过大，则应稀释；浓度过小则应通过离 心加以浓缩。应使在随机观测时，细胞总数在200-500之间。 在观测时，应防止将同一细胞数两次。因此可数5个大方格(每个大方格含有16个 小方格)：1个在中间，另4个在计数板的四周。 每个方格应数两次，取两次计数的平均值，计算出400个小方格的细胞数，然后乘 以104，以表示每ml中的细胞数。如果样品经过浓缩或稀释，在计算时应考虑浓缩或稀 释的倍数。
5.取样技术
所取样品应具代表性，可分别用取样阀或长玻璃管在酒罐或木桶中取样。但在取 样前应对环境进行消毒以防微生物污染。如用取样阀取样，应在取样前先放出数升。 此外，应用70%的酒精或灼烧对接触表面消毒。 取样后应尽快分析；样品在贮、运时应保持低温(4℃-5℃)。
1.稳定性试验
目的 检测微生物病害的可能性。 原理 当将葡萄酒置于一定的通风和温度条件下，由于微生物的活动，会引起其 感官特性的变化(如浑浊，产膜，沉淀，颜色改变等)。如有上述变化，则必须用微生 物检验其变化的性质。 操作 1.1 氧化试验 取杀菌后的粗滤纸过滤后的50ml酒样，置于用棉塞塞住的杀菌后的150ml三角瓶 中，在室温下放置最少3天后检查其澄清度，颜色，有否浑浊、沉淀、产膜。如有上述 现象，则应进行微生物检验。 1.2 培养箱试验 取用经消毒粗滤纸过滤后的100ml酒样置于用棉塞塞住的消毒三角瓶中，在30℃的 培养箱中培养72小时后检查其感官特性，如感官特性发生变化，则应进行微生物检 验。
4.用具
无菌操作室；超净工作台：培养箱(20℃-35℃，带温度计)；烘箱(干燥箱)；干燥
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灭菌箱(180℃，带温度计)；CO2气瓶；高压蒸汽灭菌锅。
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用油镜进行观测。 结果 乳酸菌为紫色或深蓝色(革兰氏阳性)，醋酸菌为红色(革兰氏阴性)。 2.4 酶分析 目的 酶分析的目的是区分醋酸菌和乳酸菌。酵母菌和醋酸菌为阳性反应，乳酸 菌为阴性反应。 备注 酶分析不是绝对的，因为除乳酸菌和醋酸菌而外，可能还有其它的细菌。 原理 酶分析是建立在好气微生物能将双氧水分解并释放出氧气的特性的基础之 上的：
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酿酒 NIANG JIU
1999年 第4期 No.4 1999
葡萄汁和葡萄酒微生物分析(微生物的监测、分类和计数)国际 标准*
李华 刘延琳 王华
● 目的 微生物分析的目的是，监控酒精发酵和(或)苹果酸——乳酸发酵的进程，显示可 能的微生物病害，以便在葡萄酒酿造的各个阶段及最后产品中监测出所有的不正常现 象。 ● 注意 所有的操作必须利用无菌材料，以满足在微生物学工作中的无菌条件。在进行微 生物分析前，必须正确取样。 ● 实用范围 微生物分析实用于葡萄酒、葡萄汁、发酵醪、蜜甜尔以及微生物破败后的上述产 品。 ● 微生物分析技术 根据不同的需要，微生物的分析可采用下列技术。
1.稳定性试验
1.1 氧化试验 1.2 培养箱试验
2.微生物检测、鉴定和酵母菌直接计数
2.1 液体或沉淀物的直接镜检 2.2 亚甲基蓝活体染色 2.3 革兰氏染色 2.4 酶分析 2.5 酵母菌直接镜检计数
3.微生物培养计数
3.1 固体培养基培养 3.1.1 平板培养法(活菌计数) 3.1.2 滤膜法(滤膜培养法)
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殖，并形成肉眼可见的菌落。 3.1.1 平板培养 目的 平板培养适宜于微生物浓度比较高，需稀释后计数的样品。 用具 除以上所列出的用具外，还需要57cm2的培养皿(塑料)或65cm2的培养皿 ［派热克斯(Pyrex)玻璃］。 缓冲液(稀释液)和固体培养基(见附件4和5)。 操作 将微生物接种到培养基中或培养基的表面，经过一定时间培养后，培养皿中直接 计数。 稀释 由于事先不知道样品中的微生物数量，所以，样品的稀释应该逐渐进行，每次稀 释十倍，以便获得适合菌落计数和鉴别的微生物数量(30-300个菌落)。为了确定稀释倍 数，可先用显微镜进行观测。将样品摇匀后，用稀释液制备一系列的十倍(1∶10)的稀 释样。具体操作如下。 取1ml样品和9ml稀释液装入第一个试管中，摇匀。取1ml第一个试管的稀释样和 9ml稀释液装入第二个试管中。依次继续进行，直到最后一个试管具有合适的浓度。每 次稀释时，都应用无菌吸管(具体操作见附件1的简图)。 倾注式接种 每个培养皿中的菌落数最好在30-300之间。 取1ml样品和1ml每个稀释样，接入相应的两个培养皿立即摇匀。取样时，应使用 相应的无菌吸管。然后，注入15ml42℃-45℃的事先在水浴中溶解的相应的琼脂培养 基，立即轻轻地摇匀，并防止产生气泡和溢出培养皿。将接种后的培养皿放在平面 上，使之凝固。 涂布接种 取0.1ml-0.2ml的稀释样，接种到琼脂培养基的表面，并防止表面上的液体过多。 用经酒精和火焰灭菌后的玻璃棒，将接种液均匀地涂在培养基的表面。 将接种后的培养皿倒置在培养箱中进行培养： 酵母菌，20℃-25℃，在有氧条件下培养3-10天〔对酵母菌计数，一般情况下培养3 天就足够了，但是，如果怀疑有Dekkera 酒香酵母(Dekkera Brettanomyces)，则应培养710天〕； 乳酸菌，25℃，在无氧条件下培养4-10天； 醋酸菌，25℃-30℃，在有氧条件下培养2-4天。 然后用肉眼或使用放大镜计数形成的菌落数。如果有疑问，可用显微镜对菌落进 行鉴定。 在每次试验中，都应用无菌水对培养基、稀释液和用具进行空白试验，以检验它 们的无菌性。 结果 结果的表述为菌落单位/ml(UFC/ml)(因为每一个菌落可能是由一个或一群微生物 细胞形成的)，而且应用10n表示(如1100应表述为1.1×103UFC/ml)。 如果菌落数为估计计算数，则结果应表述为UFCE/ml。 计数应选择菌落数在30-300个的培养皿进行。 计算菌落单位时，先计算所涉及到的菌落的平均值，然后再乘以稀释倍数。 标出培养天数。
3.微生物的培养计数
目的 微生物培养计数的目的是，鉴定样品的微生物感染的可能性，即预测它的 微生物稳定性，因为只有活的微生物才能感染葡萄酒。根据所用的培养基和培养条件 不同，我们可以对酵母菌、乳酸菌和醋酸菌三种微生物进行计数。 3.1 固体培养 原理 将活的微生物植入选择培养基，并在适宜的条件下培养，微生物就会繁
2.微生物检测、鉴定和酵母菌直接计数
2.1 液体或沉淀物的镜检 目的 直接镜检是为了观测、区分可能存在的酵母菌和细菌。但是，直接镜检并 不能区分死、活微生物。 备注 使用活体染色法，可检测活酵母菌数。 原理 利用显微镜的放大原理，可观测到大小只有以微米计的微生物。 操作 可以直接用液体或沉淀物在显微镜下观测。但液体直接镜检只有当其微生 物群体数量足够大(＞5×105)个细胞/ml)才有效。 如果葡萄酒中的微生物群体量较低，则应通过离心浓缩后再镜检：取10ml摇匀的 酒样，用3000-5000转/分离心5-15分钟，去除上清液，将沉淀与剩余的酒样摇匀后镜 检。
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镜检：用经消毒的吸管取一滴液体或摇匀后的沉淀物置于一干净的载玻片上，盖 上盖玻片，用显微镜观察。计数时应选取5个不同的视野计数，然后用每立方厘米含有 的细胞数表示。如果细胞数量太多，则应进行稀释。放大倍数通常为400-1000。 2.2 甲基蓝活体染色 目的 区分活酵母和死细胞。 原理 活细胞中的酶可使染料还原。例如，生活细胞可将甲基蓝还原成隐色化合 物而为无色，死细胞则吸附色素而变为蓝色。 试剂 0.1%甲基蓝溶液。制备：取0.1g甲基蓝在三角瓶中用100ml蒸馏水溶解后即 可。甲基蓝溶液必须为新配制的。 操作 取一滴样品和一滴甲基蓝溶液置于载玻片上，用接种环(针)混匀，5分钟后 在显微镜下直接观察。 结果 活细胞无色，死细胞为蓝色。 备注 该染色法并不可靠，只能用于粗略计数，不推荐将它用于细菌。为了区分 微生物(特别是酵母菌和细菌)最好使用如荧光显微技术等更为可靠的方法。 2.3 革兰氏染色法 目的 革兰氏染色的目的是为了区分乳酸菌(革兰氏阳性)和醋酸菌(革兰氏阴性)， 并观测它们的形态。 备注 革兰氏染色并不是绝对的，因为除了乳酸菌和醋酸菌外，还可能存在其它 的细菌。 原理 革兰氏染色法是建立在由于革兰氏阴性和阳性细菌间细胞壁结构及化学成 分的不同所引起的差异上的。革兰氏阴性菌的细胞壁富含类脂质，而肽聚糖含量很 少，酒精可穿过细胞壁，溶解结晶紫碘液，使细胞保持无色。相反，革兰氏阳性菌细 胞的细胞壁含有大量的肽聚糖，脂肪含量则很少；因此，肽聚糖的厚度及酒精对它的 水解使酒精不能进入细胞，从而使细胞保持由结晶紫碘液染成的紫色或深蓝色。 革兰氏染色技术有几种不同的变化。如果细菌的培养时间过长，则革兰氏染色法 会失去其精确性。因此，用于染色的细菌应在其对数生长期，即培养24-48小时。 试剂 所用的水必须是蒸馏水。 1)结晶紫溶液 制备：称取2g结晶紫，在100ml三角瓶中用20ml95%的酒精溶解。 在80ml蒸馏水溶解0.8g草酸铵，混合以上两种溶液，24小时后使用。在使用时用滤纸过 滤，在深色瓶中避光贮藏。 2)路哥氏(LUGOL)碘液 制备：在少量水(4-5)ml中溶解2g碘化钾，然后再溶解1g 碘片，定容至300ml。在深色瓶中避光贮藏。 3)复染液(蕃红染色液) 制备：在100ml的三角瓶中，先用10ml的95%酒精溶解0.5g 蕃红，再加入90ml的水。搅拌后，在深色瓶中避光贮藏。 操作 标本涂片的制备：将细菌接种在固体或液体培养基上。如是液体培养，则用离心 收取新鲜培养的沉淀物，或用接种针或接种环直接从固体培养基上取出细菌，并在一 滴无菌水中混 匀。 取一滴细菌悬浮物平摊在载玻片上以制备标本涂片。晾干后，在火焰上迅速通过3 次使之固定。冷却后，进行染色。 染色：在已固定的标本涂片上滴几滴结晶紫溶液，反应2分钟后用水冲洗。 滴1-2滴路哥氏碘溶液，反应30秒后用水冲洗，并用滤纸吸干。 滴几滴蕃红复染液，反应10秒钟后用水冲洗，并用滤纸吸干。
显微镜；精度为±0.1的pH仪；离心机；水浴锅；酒精灯；电炉；精度为0.1mg的 天平；血球计数板；载玻片；盖玻片；滤纸；油浸物镜用油(香柏油)；本生灯；70%和 95%的酒精。 除菌膜过滤设施：微孔滤膜，直径13mm或25mm，孔径0.22μm；平底漏斗；抽滤 瓶；真空泵等。 100ml和1000ml容量瓶；5、100、300、500、1000ml移液管(或量筒)；经消毒的1、 10、15、20和25ml吸管；经消毒的离心管； 备注：亦可使用等效的其它设备。
试剂 3%双氧水：取10ml30%的双氧水，用新鲜制备的蒸馏水定容至100ml，摇匀 后装入深色瓶在冰箱中储备用。3%的双氧水溶液必须在使用前新鲜配制。 操作 滴一滴3%的双氧水在载玻片上，并植入一点新鲜的菌落。如果有气体释 放，则表明该菌含有氧化酶。但是，由于很难直接观测到气体的释放，建议最好在10 倍的显微镜下观测。 2.5 酵母菌的直接计数 目的 观测酵母菌的群体数量(包括活细胞和死细胞) 备注 此项技术只实用于酵母菌的计数，对于细菌，由于其个体太小和胶体离子 的影响，而不能直接计数。在此情况下，可用甲基蓝染色法粗略观测细菌活细胞的数 量。 原理 用已知容量的样品直接在显微镜下观测计数。所需设备为特殊的细胞计数 载玻片。 备注 载玻片与盖玻片一起可容纳已知量的样品。但是，计数板具有不同的种 类。例如，血球计数板的面积为1mm2，深度为0.1mm，而且被均分为400个小方格，所 以每个方格中所含有的样品量为1/400mm3。 操作 取一滴摇匀的样品置于载玻片的计数板中，盖上盖玻片，并防止计数板中产生气 泡。静止几分钟以固定样品。 但是，样品的浓度不能太大或太小。浓度过大，则应稀释；浓度过小则应通过离 心加以浓缩。应使在随机观测时，细胞总数在200-500之间。 在观测时，应防止将同一细胞数两次。因此可数5个大方格(每个大方格含有16个 小方格)：1个在中间，另4个在计数板的四周。 每个方格应数两次，取两次计数的平均值，计算出400个小方格的细胞数，然后乘 以104，以表示每ml中的细胞数。如果样品经过浓缩或稀释，在计算时应考虑浓缩或稀 释的倍数。
5.取样技术
所取样品应具代表性，可分别用取样阀或长玻璃管在酒罐或木桶中取样。但在取 样前应对环境进行消毒以防微生物污染。如用取样阀取样，应在取样前先放出数升。 此外，应用70%的酒精或灼烧对接触表面消毒。 取样后应尽快分析；样品在贮、运时应保持低温(4℃-5℃)。
1.稳定性试验
目的 检测微生物病害的可能性。 原理 当将葡萄酒置于一定的通风和温度条件下，由于微生物的活动，会引起其 感官特性的变化(如浑浊，产膜，沉淀，颜色改变等)。如有上述变化，则必须用微生 物检验其变化的性质。 操作 1.1 氧化试验 取杀菌后的粗滤纸过滤后的50ml酒样，置于用棉塞塞住的杀菌后的150ml三角瓶 中，在室温下放置最少3天后检查其澄清度，颜色，有否浑浊、沉淀、产膜。如有上述 现象，则应进行微生物检验。 1.2 培养箱试验 取用经消毒粗滤纸过滤后的100ml酒样置于用棉塞塞住的消毒三角瓶中，在30℃的 培养箱中培养72小时后检查其感官特性，如感官特性发生变化，则应进行微生物检 验。
4.用具
无菌操作室；超净工作台：培养箱(20℃-35℃，带温度计)；烘箱(干燥箱)；干燥
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灭菌箱(180℃，带温度计)；CO2气瓶；高压蒸汽灭菌锅。
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用油镜进行观测。 结果 乳酸菌为紫色或深蓝色(革兰氏阳性)，醋酸菌为红色(革兰氏阴性)。 2.4 酶分析 目的 酶分析的目的是区分醋酸菌和乳酸菌。酵母菌和醋酸菌为阳性反应，乳酸 菌为阴性反应。 备注 酶分析不是绝对的，因为除乳酸菌和醋酸菌而外，可能还有其它的细菌。 原理 酶分析是建立在好气微生物能将双氧水分解并释放出氧气的特性的基础之 上的：
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1999年 第4期 No.4 1999
葡萄汁和葡萄酒微生物分析(微生物的监测、分类和计数)国际 标准*
李华 刘延琳 王华
● 目的 微生物分析的目的是，监控酒精发酵和(或)苹果酸——乳酸发酵的进程，显示可 能的微生物病害，以便在葡萄酒酿造的各个阶段及最后产品中监测出所有的不正常现 象。 ● 注意 所有的操作必须利用无菌材料，以满足在微生物学工作中的无菌条件。在进行微 生物分析前，必须正确取样。 ● 实用范围 微生物分析实用于葡萄酒、葡萄汁、发酵醪、蜜甜尔以及微生物破败后的上述产 品。 ● 微生物分析技术 根据不同的需要，微生物的分析可采用下列技术。
1.稳定性试验
1.1 氧化试验 1.2 培养箱试验
2.微生物检测、鉴定和酵母菌直接计数
2.1 液体或沉淀物的直接镜检 2.2 亚甲基蓝活体染色 2.3 革兰氏染色 2.4 酶分析 2.5 酵母菌直接镜检计数
3.微生物培养计数
3.1 固体培养基培养 3.1.1 平板培养法(活菌计数) 3.1.2 滤膜法(滤膜培养法)