辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症因子的影响

辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症因子的影响
发表时间：2013-09-04T11:02:49.217Z 来源：《医药前沿》2013年第23期供稿作者：王永彬1 蔺记芹2 王伟1(通讯作者)
[导读] 大鼠IL-8ELISA试剂盒：美国R&D公司产品。

大鼠TNF-α ELISA试剂盒：武汉博士德生物工程公司产品。

王永彬1 蔺记芹2 王伟1(通讯作者)
(1山东大学第二医院呼吸科 250033)
(2山东大学齐鲁医院 250012)
【摘要】目的本研究用辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）大鼠进行干预，从大鼠的一般状况、血清中主要炎性因子白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白（CRP）的测定及肺组织中炎症因子的表达，探讨辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病治疗中的抗炎作用机制。

方法采用熏香烟加气管内滴入LPS法建立大鼠COPD模型，随机将60只雄性Wistar大鼠分为正常对照组、COPD模型组和辛伐他汀治疗组，治疗组在造模两周后给予辛伐他汀2.5mg/kg灌胃治疗，每天1次，治疗6周后，观察各组大鼠的体质量增长率，使用酶联免疫法（ELISA）分别测定血清中IL-8、TNF-α、C反应蛋白（CRP）的水平。

采用免疫组化方法（SABC 法）测定肺组织中IL-8、TNF-α炎性细胞因子的表达。

结果治疗组较模型组体质量增长率提高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组血清IL-8、TNF-α、CRP浓度均降低（P<0.05）。

各组大鼠肺组织中IL-8、TNF-α的表达，与模型组相比，治疗组表达均减少（P<0.05）。

结论辛伐他汀可降低COPD大鼠模型血清中的炎症因子，减轻肺组织及气道炎症，对COPD大鼠的炎症有抑制作用。

【关键词】肺疾病慢性阻塞性炎症大鼠辛伐他汀
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）23-0140-02
慢性阻塞性肺疾病是一种重要的而且患者人数不断增加的全球健康问题，该疾病死亡率高，造成了严重的社会经济负担，已经成为一种严重的公共卫生问题[1]。

国内外研究表明，他汀类药物（statins）除调脂作用外，还具有多向性效应，具有保护改善血管内皮、抗炎[2]、调节中性粒细胞功能、抗氧化、免疫调节、调节凋亡[3]等作用。

其中抗炎、调节凋亡作用可能与COPD相关。

本研究用辛伐他汀对COPD大鼠进行干预，通过对血清中主要炎性因子IL-8、TNF-α、CRP的测定及肺组织中炎症因子IL-8、TNF-α的表达，探讨辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病治疗中的抗炎作用机制。

1 研究对象及材料
健康SPF级雄性Wistar大鼠60只，体质量为（224.5±6.9）g，由山东大学医学院实验动物中心提供，于实验前1周开始饲养于山东大学第二医院实验动物中心。

脂多糖(LPS)系美国Sigma公司产品；辛伐他汀片(京必舒新)10 mg／片，由浙江京新药业股份有限公司生产；大鼠IL-8ELISA试剂盒：美国R&D公司产品。

大鼠TNF-α ELISA试剂盒：武汉博士德生物工程公司产品。

C-反应蛋白（CRP）测试所需要的设备及试剂IMMAGE-800特种蛋白分析仪：美国Backman公司产品，采用仪器上随机携带的试剂检测；SP法试剂盒和DAB液购自北京中杉金桥生物有限公司；兔抗鼠IL-8多克隆抗体、兔抗鼠TNF-α多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司。

哈德门牌香烟由山东中烟工业公司提供，焦油含量13 mg，烟气烟碱量1.2 mg，烟气一氧化碳量15 mg。

2 方法
2.1COPD大鼠模型的建立和分组
按随机数字表法将大鼠分为正常对照组、COPD模型组、辛伐他汀治疗组，每组20只，各组间体重无差异。

正常对照组：标准饲养，不作任何干预；COPD模型组：第1、14天将大鼠以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，通过气管插管向大鼠气管内注入
LPS200μg/200μl，完毕后将大鼠直立旋转10～20s，使LPS均匀分布于肺部。

第2～13d、15～28d每天在自制有机玻璃密闭熏烟箱（80cm×60cm×50cm），持续吸入香烟烟雾30min,15支/d；辛伐他汀治疗组：经气管内注入LPS的条件、烟熏条件以及持续时间均同模型组，在大鼠经气管内注入LPS满2周后，用辛伐他汀灌胃治疗（剂量2.5mg/kg），药物治疗6周后同时处死3组动物。

处死前分别测定各组大鼠的体质量，并进行动物处置及标本采集。

2.2炎症因子测定
采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF及血清中IL-8、TNF-α的含量，严格按照试剂盒说明进行操作，并利用免疫组化法测定IL-8及TNF-α。

2.3血清CRP的检测
应用IMMAGE-800特种蛋白分析仪（美国Backman公司）测定血清CRP的浓度。

3 统计学处理
应用SPSS 17.0系统软件进行统计学分析。

计数资料以均数±标准差（x-±S）表示，三组间均数比较采用方差分析，样本均数间两两比较采用q检验，即Newman-kueuls法。

用Pearson相关分析方法分析两变量之间的关系。

P<0.05为差异有统计学意义。

4 结果
4.1 一般情况及存活率比较
4.1.1 存活率情况
试验开始前每组大鼠各20只，经饲养及相应处理后，正常对照组大鼠存活18只，模型组大鼠存活16只，治疗组大鼠存活17只。

对存活大鼠行各因子测定、免疫组化等检测。

4.1.2 各组一般情况及体质量增长率的比较
与模型组相比，治疗组一般情况较之改善；治疗组大鼠体质量增长率较模型组有显著提高，有统计学意义（P<0.01），结果见表1。

表1 一般情况及体质量增长率（x-±S，N1=18，N2=16，N3= 17）
注：与正常对照组比较* P<0.05，** P<0.01，与模型组比较△ P<0.01
4.2 各组大鼠血清中IL-8、TNF-α、CRP的浓度
血清中IL-8、TNF-α、CRP浓度在三组间的差异具有统计学意义（P<0.01），模型组大鼠血清中IL-8、TNF-α、CRP浓度均较正常对照组显著提高（P<0.01），辛伐他汀治疗组大鼠血清中IL-8、TNF-α、CRP浓度较正常对照组显著提高（P<0.01），辛伐他汀治疗组大鼠血清中IL-8、TNF-α、CRP浓度较模型组降低（P<0.05）。

结果见表2。

表2 血清中IL-8 、TNF-α、CRP浓度（x-±S，N1=18，N2=16， N3=17，ρ/pg•mL-1）
注：与正常对照组比较** P<0.01，与模型组比较▲P<0.05，△P<0.01
3. IL-8、TNF-α免疫组织化学结果
IL-8主要表达于单核巨噬细胞、淋巴细胞等的胞浆中，肺泡上皮细胞、细支气管上皮细胞及小血管内皮细胞中也可见到阳性表达，与正常对照组相比，模型组及治疗组表达增多（P<0.05），治疗组与模型组相比，IL-8的表达减少（P<0.05）；TNF-α主要表达于肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞等，与正常对照组相比，模型组及治疗组表达增多（P<0.05），治疗组与模型组相比，TNF-α的表达减少（P<0.05）。

结果见表4。

表3 各组大鼠肺组织IL-8、TNF-α的表达（x-±S，N1=18，N2=16， N3=17）
注：与正常对照组比较* P<0.05，与模型组比较▲ P<0.05
5 讨论
慢性阻塞性肺疾病由于其患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题。

有研究预计，到2020年COPD 将成为全球第五位的慢性致残原因，造成了巨大的社会经济负担。

COPD的发病机制至今尚未完全明了，尽管临床上用于治疗COPD的药物众多，但尚无药物能够有效阻断COPD病情的进展，阻止肺功能下降。

他汀类药物除了具有调脂作用之外还具有抗炎、抗氧化及调节细胞凋亡的作用[4]。

他汀类药物具有广泛的抗炎作用。

在对体外循环术后患者的研究中发现应用他汀类药物可使血清中IL-6、IL-8明显降低，中性粒细胞凋亡增加，炎症反应减弱[5]。

在大鼠的急慢性炎症模型中亦发现他汀类药物对急慢性炎症均有不同程度的抑制作用。

我们的研究发现，在COPD模型大鼠中，应用辛伐他汀治疗后，大鼠血清中IL-8及TNF-α较COPD模型组显著下降（P<0.01）。

免疫组化显示应用辛伐他汀治疗后，与COPD模型大鼠相比，IL-8与TNF-α仍表达于单核巨噬细胞、淋巴细胞、肺泡上皮细胞、细支气管上皮细胞及小血管内皮细胞等细胞等细胞中，但表达减少（P<0.05）。

表明：在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，辛伐他汀可以抑制局部肺组织IL-8及TNF-α的表达，抑制中性粒细胞、淋巴细胞及单核-巨噬细胞等炎性细胞的聚集，从而对慢性阻塞性肺疾病局部肺组织的炎症起抑制作用。

其机制可能为辛伐他汀通过下调炎性细胞因子mRNA的表达，减少单核细胞白细胞介素-6、白细胞介素-8、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达，并阻碍核转录因子(NF-KB)在人体单核细胞激活的信号通路，抑制NF-KB的活性，从而抑制这几种参与炎症反应的编码蛋白的表达，从而降低局部肺组织内IL-8及TNF-α的水平，从而减少肺组织中中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等炎症细胞的浸润和聚集，减轻肺部炎症。

另一方面，辛伐他汀可能影响血管内皮细胞和炎症细胞的相互作用，抑制炎症细胞的滚动和黏附作用，减少其对血管壁的黏附，削弱P选择素的表达和复合酯酶的上调，从而降低炎症细胞在炎性组织的聚集。

对他汀类药物抗炎机制的最新研究表明：他汀类药物主要影响甲羟戊酸的合成途径，从而减少了多种类异戊二烯的合成。

他汀类药物通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶阻止甲羟戊酸途径的胆固醇的合成，并且影响了许多类异戊二烯的合成。

类异戊二烯可以与小G蛋白结合，并且使之异戊稀化，从而激活小分子单体G蛋白，进而激活Rho激酶，起到信号转导的作用。

他汀类药物影响了类异戊二烯的合成，从而影响了Rho/Rho激酶信号途径，起到抗炎作用[6]。

通过上述抗炎机制，辛伐他汀抑制肺部组织炎症。

同时，辛伐他汀可以减轻慢性阻塞性肺疾病的全身炎症反应。

我们的研究发现，应用辛伐他汀治疗后，COPD模型大鼠血清中IL-8显著降低（P<0.01），TNF-α及CRP亦明显降低（P<0.05），而且大鼠的被毛、饮食及咳嗽等一般状况较前有所改善，体质量增长率较COPD模型组显著增加（P<0.01）。

表明在慢性阻塞性肺疾病大鼠中，辛伐他汀可以改善全身炎症水平，大鼠一般状况的改善可能与全身炎症反应的减轻有关。

目国外的临床实验表明，他汀类药物能减少慢性阻塞性肺疾病患者的发病率和病死率[7],表明他汀类药物的多效性在COPD的治疗中有潜在的价值，有望提供新的药物选择。

但由于目前辛伐他汀在COPD临床领域的研究还较少，对COPD患者的远期疗效，还需要大规模、多中心、随机、双盲的临床实验予以进一步证实。

参考文献
(1) Soriano JB, Rodríguez-Roisin R. Chronic obstructive pulmonary disease overview: epidemiology, risk factors, and clinical presentation [J]. Proc Am Thorac Soc. 2011, 8(4):363-7.
(2) Duan S, Zhang Y, Wu SJ, Jiang LZ, Zhang J, Gan Y, Chen P, Zhao SP, Li GY.Atorvastatin attenuates inflammatory infiltration and
vascular remodeling in lung of hypercholesterolemia rabbits.Exp Lung Res. 2010, 36(10):573-92.
(3) Sato K, Nuki T, Gomita K, Weyand CM, Hagiwara N.Statins reduce endothelial cell apoptosis via inhibition of TRAIL expression on activated CD4 T cells in acute coronary syndrome.Atherosclerosis. 2010, 213(1):33-9.
(4) Shen L, Li ZM, Lu S.Clinical significance of C-reactive protein in patients with stage I non-small cell lung cancer.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2011, 33(6):442-6.
(5) McCarey DW , Melunes IB , Madhok R ,et al. Trial of Atorvastatin in Rheumatoid Arthritis (TARA):double-blind randomized placebo-controlledtrial (J). Lancet ,2004 ,363(9426) :2015-2021.
(6) Za char ias E . Sunt res: Liposomal Antioxidants for Protect on against Oxidant-Induced Damage. Journal of Toxicology Volume 2011, 16-20.
(7) Gallelli L,Pelaia G,Fratto D,Muto V,Falcone D, Vatrella A,Curto LS,Renda T,Busceti MT,Liberto MC,Savino R,Cazzola M,Marsico SA,Maselli R.: Effects of budesonide on P38 MAPK activation,apoptosisandIL-8secretion, induced by TNF-alpha and Haemophilus influenzae in human bronchial epithelial cells. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010 ,23(2):471-9.。