分子诊断临床应用进展

分子诊断技术的分类
根据目的基因是否被放大分类 可分为杂交法和扩增法
根据被测基因的核酸类型分类 Southern印迹用于检测 DNA；Northern印迹用于检测RNA；斑点印迹或称斑点 杂交，既可检测DNA也可检测RNA。 根据诊断目的或要求 分为定性诊断、定量诊断和半定量 诊断，以及序列分析等
根据分子之间的作用形式 杂交、扩增、测序
荧光原位杂交（FISH）
原位杂交应用特异性的探针检测细胞内的核酸需要标记分子显示杂交信号，1960s 年代的检测技术是放射性核素标记，但是信号检测程序复杂并且可能存在放射性 物质的污染，而荧光物质标记可以通过显微镜直接观察实验结果，因此荧光标记 的原位杂交技术（Fluorescent in situ hybridiztion，FISH）一经出现立刻取代了放射 性标记的技术，成为应用最广泛的分子杂交技术。FISH技术通过荧光标记探针， 可以可视化的检测人类细胞或组织中特定基因的数量及其定位，是分子杂交与细 胞遗传学技术的结合。 IFSH技术的分析过程分为四个步骤，核酸变性、探针变性、杂交及信号检测。因 此，针对探针标记、染料开发和图像分析的技术的更新是FISH分析技术发展的主 要路径。
基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用 基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用
基于分子杂交的分子诊断技术及其应用
两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传 物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交（molecular hybridization）。 分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交（southern Blot和 northern Blot）到实时PCR（real time PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序 技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。而且在理论上可以特异性相互作用的 两个不同分子，例如核酸与核酸之间（A-G、G-C）、蛋白与蛋白之间（抗原和抗 体）甚至核酸和蛋白之间（适体与多肽）的相互作用都可以视为分子杂交的不同 表现模式。 因此，广义的分子杂交技术是指以核酸、蛋白、糖基以及细胞、代谢物等分子的 相互作用所建立的分析方法。目前临床应用的以分子杂交技术为基础的诊断技术 繁多，缺乏统一的分类方法，但是可以根据实验方法的差异分为主要的两种类型， 一类是通过特异性的标记探针检测检测细胞内的核酸物质，而另一类是通过探针 检测从细胞内提取的核酸、蛋白等物质，前者以原位杂交及其衍生的技术为主， 后者以生物芯片及其衍生的技术为主。
生物芯片技术
荧光原位杂交结果
Journal of Cell Science 2003；116 （14）
FISH的应用
在产前诊断方面，FISH主要用于染色体数目异常的诊断，与常规核型分析的一致 性可以达到99.5％，但结果报告时间只要24小时，大大低于核型分析的平均2周左 右的报告时间，FISH在多数的发达国家已经批准为常规产前筛查辅助诊断技术。 在血液肿瘤的诊断方面，FISH用于染色体异位的融合基因检测、基因缺失检测、 微小残留病灶监测、骨髓移植监测等。 在感染性疾病检测方面，FISH检测痰液标本中铜绿假单饱菌、流感嗜血杆菌等常 见菌的敏感性可以达到90％，特异性100％［9］。对于军团菌、幽门螺旋杆菌和结 核杆菌等较难培养鉴定的细菌，FISH在快速诊断上也显示了很好的应用前景。 在实体肿瘤的应用中，FISH可以检测任何组织类型的染色质和基因的异常，广泛 应用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等实体肿瘤的肿瘤的辅助诊断，疗效检测、 个体化治疗和预后判断。FISH用于药物靶向性基因表达状态的检测。在乳腺癌治 疗药物曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗有效性患者筛选中，FISH被认为是检测HER2基因 表达状态的金标准。
“链式反应”改变世界
核裂变链式反应
分子诊断概念的变化
分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化 而做出诊断的技术，称为分子诊断。分子诊断是预测诊断的主要方法，既可以进 行个体遗传病的诊断，也可以进行产前诊断。分子诊断的材料包括DNA、RNA和 蛋白质。 基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直 接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。 分子生物学：从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、 化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递， 基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信 号的转导等。
荧光原位杂交衍生技术
首先是荧光染料的应用，从最初的单色FITC应用，发展到使用多种荧光染料的多 色FISH技术，既多元荧光原位杂交和光谱核型分析技术，使用五种染料 （Rhodamine, Texas-red, Cy5, FITC, and Cy5.5）标记的探针可以在一次试验中定位 多种不同的基因以及使用不同的颜色标记显示24条不同的染色体。 其次，在探针方面，染色体臂、着丝粒、端粒特异的探针被先后开发应用，而且 应用微切割技术切割技术制备亚区域探针（microFISH），使FISH的基因定位和分 辩率大大提高［6］。 同时，探针标记对象和标记技术的发展不断衍生出新的FISH技术，例如比较基因 组杂交、引物原位标记技术、肽核酸探针原位杂交、物种交叉荧光原位杂交、纤 维原位杂交等。 在图像与信号分析方面，应用高分辨率CCD摄像机和计算机自动图像分析系统获 得广泛应用，而SKY结合傅立叶频谱技术，同时计量可见光和近红外范围内的所 有点的发射频谱而一次成像。
分子诊断临床应用进展
主要内容
分子诊断概念的演变
分子诊断技术的分类
基于杂交基础的分子诊断技术及其应用 基于扩增基础的分子诊断技术及其应用 基于测序基础的分子诊断技术及其应用 分子诊断应用前景展望
多ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
Polymerase: DNA聚合酶