preMiD基因突变检测技术原理和应用

preMiD™基因突变检测技术原理和临床应用简介：

原癌基因和抑癌基因的驱动突变（driver mutation）是肿瘤特有的标记。以PreGen-Plus™筛查大肠癌4基因突变的粪便筛查被FDA批准为标志，更多突变检测肿瘤的新技术和产品处于临床开发阶段。自主创新的preMid™技术可一次检测38个基因198突变点，覆盖包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌和胃癌等14种肿瘤，国际上第一次实现多突变的血浆检测。临床验证preMid™技术可实现癌症（超）早期，疑似患者的辅助诊断和术后复发的实时监控，总体准确率可达80%。

正文：

原理：

1. 突变——肿瘤特异标志。

癌症是基因突变累积的结果。“所有癌症的发生，都源自脱氧核糖核酸（DNA）序列的异常。”国际癌症基因组联合计划参与单位之一、英国剑桥大学桑格研究所首席科学家斯特拉顿教授指出。

癌变的形成要经过8--10年甚至更长，而这漫长的时间其实就是一个多基因突变并累积的过程（图1）。肿瘤相关基因可分为原癌基因和抑癌基因，其中起主要作用的突变属于驱动型突变（driver mutation）。当抑癌基因突变失去抑制癌症作用，或原癌基因突变激活，就会诱发癌症。正常细胞在向癌细胞转化的过程中，发生多种不同原癌基因和抑癌基因突变。

图1 肿瘤是基因突变的结果

相比临床检测中常规使用的肿瘤蛋白血清标志物，突变无疑是更特异的肿瘤标记。

2009年12月，桑格研究所在《自然》杂志上刊文宣布，他们率先在世界上破译肺癌、

皮肤癌和乳腺癌等5种肿瘤全部基因密码，绘制出相应的肿瘤基因突变图谱（表1）。

表1 5种癌症基因突变相关数据

Nature.2010.8;466(7308):869-873.

2.循环DNA是检测突变的重要来源

肿瘤起源DNA存在于血液循环DNA中。循环DNA存在于血清或血浆、滑膜液和脑脊液等体液中的非细胞里面存在的片段，亦称细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。

早在1947年Mandel和Metais就发现循环核酸；30年后Leon等研究表明肿瘤患者外肿瘤患者cfDNA水平大大高于正常人1989年Stroun等发现血液游离DNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征；5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到癌基因突变，与原发肿瘤一致。

图2 肿瘤cfDNA来源示意图

肿瘤细胞cfDNA如何进入血液，目前认为：1) 循环肿瘤细胞或微转移灶的裂解；2) 肿瘤细胞的凋亡；3) 肿瘤细胞坏死；4) 肿瘤细胞自发性释放。

cfDNA突变检测具有特异、实时且无创等突出特点，无疑是肿瘤早期筛查、辅助诊断、预后判断及跟踪复发等有效靶标。

肿瘤突变检测进展

1.早期筛查

1）PreGen-Plus™筛查大肠癌

FDA已批准PreGen-Plus™非侵入式结肠癌粪便4基因突变筛查，主要检测APC、KRAS、P53和BAT-26等4个基因突变（图3）。美国癌症协会（ACO）和放射学会联合推荐检测该产品用于可疑人群的筛检，临床证实可检出70%结肠癌（包括早期结肠癌），还可以检测超过37%的癌前病变。

图3. 结肠癌发展过程中的基因变化

2). 肾癌筛查

福克斯·蔡斯癌症中心（(Fox Chase Cancer Center)的研究表明：尿检突变法在诊断肾癌方面具有较高精确度，还可用于对患者手术后的状况进行监测。

50名肾癌患者尿样的DNA分析均有突变，与手术肿瘤组织中发现的基因突变相一致，未患癌症的健康研究对象尿检无突变，符合率达100%。30名早期肾癌患者经尿检突变检出27人，准确性达90%。17名手术后肾癌患者尿检结果显示，他们尿样中不再含有手术前曾发现的基因突变。

2.术后复发监控

1）BEAMing

BEAMing 是一种新流式磁珠检测突变

的技术，能检测出血浆中更微量含基因突变

的片段(Nat Med. 2008.9;14(9):985-90.)。

目前，该技术主要用于肿瘤手术后的早

期复发检测，。

2）PARE技术

《科学·转化医学》 （Sci Transl

Med 2010，2（20）：20ra14）报道癌症

复发的诊断新方法。

采用重排终端个性化分析（PARE ）法，

可检测患者循环血的DNA 中突变，评估

肿瘤的治疗效果以及早期发现复发情况。

preMiD TM ——自主创新的多突变检测新技术

preMiD TM 是我国拥有自主知识产权的集成式突变检测技术平台，主要用于癌基因和抑癌

基因突变的高通量、高灵敏度的特异性检测。

1. 技术原理

preMiD TM 融合突变偏向性扩增ARMS 、荧光定量PCR 和高分辨熔解曲线分析HRM 等

3种技术于一体（下图）。

2. 技术突破：

①．实现非细胞体系的血浆微量突变检测。

②．一次检测38个基因超过198突变位点。

③．阳性符合率（85-100%），特异性近85-98%。（肿瘤不同，数据有所差别）

④．可一次筛查14种主要肿瘤，也可单独用于1种肿瘤的检测。

⑤．可实现超早期肿瘤筛查、疑似患者的辅助诊断和术后复发的实时监控。

⑥．时间短、易于操作。

3.临床应用：

●肿瘤高危人群筛查

自2010年至今，我们利用preMIDTM技术对约320名健康人、肿瘤患者所作对比检测研究中，阳性符合率达到82.6%，阴性符合率达到95.8%。

●疑似患者的辅助诊断

临床上，影像学或肿瘤血清蛋白标志物发现的疑似患者，可通过对血浆或肿块组织进行多基因突变检测，从而达到辅助诊断的目的。在北京**医院、哈尔滨、江苏和浙江的几家临床验证中，准确性有89.3-100%。

针对单个肿瘤如难以发现的胰腺癌，30例血浆突变诊断胰腺癌的实验中，病理结果作为对照，preMid TM阳性符合率达100%，阴性符合率达到93%。

●术后复发监控

目前，基于preMID TM技术平台的术后病程监控，包括结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、甲状腺癌及脑胶质瘤等十余种项目。在前期的研究中，早期发现患者复发的时间可比影像学提早3-9个月，特异性近乎100%。

附件：

1.PreMid技术报道。

/jrzg/2011-12/09/content_2016107.htm