血管内皮祖细胞研究进展

中国微循环 2002 年 2 月第 6 卷第 1 期
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例是 : 粒 - 巨噬系集落刺激因子 ( GM - CSF) 动员的外 周血 , 2. 0 % ±0. 5 % ; 脐静脉血 CD34 +组 , 1. 4 % ±0. 5 % ; 胎肝 CD34 +组 , 1. 2 % ±0. 3 % ; 正常外周血为 0. 4 % ±0. 2 % , 远低于先前用 flk - 1 多克隆抗体所得 结果 (27 %) 。表明 flk - 1 单抗可进一步把内皮祖细胞 从造血干细胞区分开来 。用荧光 PE 标记 AC133 单抗 , FITC 标记 KDR 单抗 , 行双色荧光流式细胞分析 , 结果 表明几乎所有的 CD34 +flk - 1 +细胞均表达 AC133。这 提 示 CD34 +flk - 1 + AC133 + 代 表 内 皮 祖 细 胞 亚 群 ; CD34 +flk - 1 +AC133 - 代表成熟的内皮细胞 。体外培养 的结果更证明了这一点 : CD34 +flk - 1 +AC133 +细胞随着 增殖分化成为 CD34 +flk - 1 +AC133 -的成熟内皮细胞 。以 上内皮祖细胞的特异性分子标志 , 使以后定量分析和测 定外周血及组织内的血管内皮祖细胞成为可能 。
基金项目 :2000 年度教育部高校骨干教师资助项目 。 作者单位 :400037 重庆第三军医大学新桥医院全军肿瘤中心 第一作者简介 :王卫东 (1969 - ) ,男 ,河南沈丘籍 ,医学博士 ,主治 医师 ,主要从事抗肿瘤血管生成研究 。
因 ,包括 SCL 、CD34、VEGFR - 2 等 [2 ]。进一步研究发现 , BL - CFC 在具有造血和内皮细胞生长因子的介质中可 分化为血细胞和内皮细胞 , 从而提供了 hemangioblast 存在的直接证据 。出生后 ,血液/ 血管母细胞定居于成 年机体的骨髓组织 [1 ]。
1 血管内皮祖细胞的来源 在胚胎期 ,随着卵黄囊所提供养分的耗尽 ,胚胎须 从母体获得营养 。因此在人胚胎的第 13～15d 胚外造 血已经启动 , 卵黄囊的胚外中胚层一些间充质细胞逐 渐聚集成条索或团块 ,形成血岛 (blood island) 。这些细 胞团结构进一步出现腔隙化改变 , 位于血岛外层的细 胞分化成扁平状 , 形成原始的血管内皮细胞即 an2 gioblast ; 血岛中心的细胞则变成球形 , 成为原始的造血 细胞 。多个血岛腔隙相互连接成一条管样结构 ,形成原 始血管床 , 此过程为血管生成 (vasculogenesis) 。在血管 床的基础上 , 血管内皮细胞通过出芽方式形成新的血 管分枝 , 并相互连接成血管网络 , 此为血管形成 (angiogenesis) 。 [1 ] 在血岛内造血细胞和血管内皮细胞发育的密切相 关性 , 促使 Sabin FR 早在 1920 年就提出假说 : 造血和 血管内皮细胞来源于同一前体细胞 ,即血液/ 血管母细 胞 ( hemangioblast) , 这一假设直到最近才得以证实 。研 究发现 , 造血和血管内皮细胞表达一系列相同的基 因 。比如 ,酪氨酸激酶受体 Tie/ Tek、促红细胞生成素受 体 、CD34 抗原 、VE - 钙粘素等 , 而且来自外周血的 CD34 +细胞在体外培养中可分化成内皮细胞 。晚近 Choi 等通过胚胎干细胞的体外培养 , 发现一个特殊的细胞 亚群 ,即集落形成母细胞群(BL - CFC) 。BL - CFC 可形成 多个母细胞集落 , 对这些集落内细胞进行基因表达分 析 , 发现了造血和血管内皮细胞系共同表达的多种基
2 血管内皮祖细胞的分子标志 血管内皮祖细胞是一群具有游走特征并能进一步 增殖分化的幼稚内皮细胞 , 缺乏成熟内皮细胞的特征 性表型 , 尚不能形成管腔样结构 [3 ]。仅从形态特征上 , 不能把血管内皮祖细胞识别出来 。因此 ,研究其特异性 的分子标志可为分析鉴定和筛选血管内皮祖细胞打下 基础 。 由于血管内皮祖细胞和造血干细胞来自同一祖先 细胞 , 它们之间存在许多相同的分子标志 , 比如 , CD34 单抗可同时识别出包括造血细胞 、内皮祖细胞和成熟 内皮细胞的混合细胞群 [4 ]。最近 ,应用 flk - 1 (VEGFR 2) 的膜外结构域的单抗可把造血细胞分离开来 , 但尚 不能把内皮祖细胞和成熟内皮细胞识别开 。然而 ,有三 方面的证据表明外周血 CD34 +flk - 1 +细胞主要是内皮 祖细胞 : ①实验证明 ,外周循环的成熟血管内皮细胞数 量极少 , 约 2～3 个/ ml , 而血管内皮祖细胞约为 500～ 1000 个/ ml ,两者比例相差悬殊 ; ②在动物移植模型中 , 移植的成熟内皮细胞不参加血管的新生 , 而内皮祖细 胞经移植后可参与受体的血管新生 ; ③研究中新鲜 CD34 +单个核细胞基本不表达内皮细胞的特异性分子 标志 , 而培养 7d 后成熟内皮细胞的分子标志明显增 加 , 说明循环中的 CD34 +内皮细胞主要为内皮祖细胞 , 成熟内皮细胞很少 。 目前 , 在寻找血管内皮祖细胞特异性标志方面有 新的进展 。AC133 是新近发现的造血干细胞早期标志 , 是分子量为 120kd 的糖基化多肽 , 含有 5 个跨膜结构 域 ,包括膜外的 N 端及胞浆内的 C 残端 。尽管 AC133 的 功能尚不明确 ,但初步的研究表明 ,它不同于现有的造 血细胞表面标志 。随着造血细胞的分化成熟 ,AC133 表 达迅速下降 。Perchev 等 [5 ]研究发现 ,AC133 在内皮祖细 胞表达 ,而成熟内皮细胞无表达 。他们用 flk - 1 的膜外 结构域单抗识别出了 CD34 +细胞一个极小亚群 , 其比
据晚近的研究 , 采用 AC133 + KDR +双荧光激活细 胞分选法 ,可得到纯度较高的 EPC ,但代价较高 。
5 血管内皮祖细胞研究的意义 组织缺血所诱导的血管新生 , 本质上是机体的一 种自然性防御反应 ,以维持组织的血流灌注 ,满足生理 的需要 。然而 ,在某些情况下 ,比如高龄老化 、糖尿病 、 高胆固醇血症等 ,机体的血管发育能力障碍 ,不仅内源 性血管生长因子合成减少 , 而且其血管内皮细胞功能 异常 ,对细胞因子的反应力也下降 。因此 ,以往只给以 血管内皮生长因子 , 不能有效地改善这些疾病的血管 发育 [8 ] , 也即在组织缺血性疾病的治疗中 ,“治疗性血 管形成”(therapeutic angiogenesis) 的疗效遇到了极限 ,这 为“治疗性血管生成”(therapeutic vasculogenesis) 带来了 新的机遇 。随着研究的深入 ,目前已证明血管内皮祖细 胞参与成年机体血管新生 。因而 ,可设想通过移植血管 内皮祖细胞 ,增强某些缺血性疾病的血管生长 。已有初 步实验结果证明了这种设想的可行性 。Murohara 等 [9 ]以 免疫缺陷小鼠为研究对象 , 从人的脐血分选富集内皮 祖细胞 ,移植到后腿缺血的裸小鼠 ,发现内皮祖细胞能 明显增强缺血组织的血流量及微血管密度 。Kalka 等 [10 ] 以无胸腺小鼠为模型 ,采集人外周血内皮祖细胞 ,经体 外扩增后 , 移植给后肢缺血的小鼠 , 得出类似结果 , 且 使小鼠的截肢率明显下降 。显然 ,内皮祖细胞不仅可直 接应用于血管发育异常性疾病的治疗 , 而且也可作为 促血管生长因子的载体 ,用于活体的基因治疗 。 出生后血管生成的研究不仅可应用于缺血性疾病 的治疗 , 对肿瘤的防治也将有重要的理论和实践价 值 。angiostatin 是目前肿瘤血管新生最强的抑制剂 。晚
·6 · 文章编号 : 1007 - 8568( 2002) 01 - 0006 - 03
血管内皮祖细胞研究进展
J . of Chinese Microcirculation Feb. 2002 ,Vol . 6 ,No ,1
·专题报告 ·
王卫东 , 陈正堂
中图分类号 : R322. 1 +2
文献标识码 : A
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J . of Chinese Microcirculation Feb. 2002 ,Vol . 6 ,No ,1
利用细胞在物理学 、生物学 、免疫学等方面的特征 差异 , 例如细胞密度和大小 , 对某些物质的吸附能力 , 表面特异性抗原等 , 可对某些细胞亚群加以分离纯 化 。由于 EPC 是 CD34 +细胞的一个亚群 ,可首先利用包 被 CD34 单抗的免疫磁珠吸附法富集骨髓 、外周血或脐 血内的 CD34 +单个核细胞 , 然后在纤连素包被的培养 板用含牛血清的细胞培养基 (如 M - 199、IMDM 等) ,加 入 VEGF、SCF 等因子进行培养 。4 天后用 PBS 洗去非贴 壁细胞 ,换以新的培养基继续培养 7～10d ,用少量胰蛋 白酶消化收集贴壁生长的梭形细胞 。进一步通过以下 途径鉴定所获细胞为 EPC: ①应用流式细胞仪检测内 皮细胞特异性分子标志 , 如 KDR、Tie - 2、UEA - 1、Von Willebrand factor 、CD31、VE - cadherin 等 ; ②通过透射电 镜观察内皮细胞特有的 Weibel - Palade 小体 ; ③乙酰化 低密度脂蛋白 (Ac - LDL) 摄取实验 [9 ] ,此为内皮细胞的 生物学特征 ; ④体外血管生成模型 ,籍此证明所获细胞 可直接参与血管新生 。
血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPC) 是 血管内皮的前体细胞 , 亦称为血管母细胞 (angioblasts) 。新近研究表明 ,血管内皮祖细胞不仅参与 胚胎期的血管发育 , 也存在于成年机体的骨髓及外周 血 ,在成体血管新生中起重要作用 。这一目前血管发育 生物学的重大发现 , 不仅为揭开血管新生机制之谜提 供了重要线索 , 也为缺血性疾病及恶性肿瘤的治疗提 供了新的靶点 。本文报告其有关进展 。
3 血管内皮祖细胞的动员 不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员 ( mobilization) ,细胞动员机制存在共同的环节 ,如粘附 、 降解 、运动 、迁移等 , 但各祖系细胞也有特异性的动员 机制 。对同一祖系细胞 ,在不同的情况下其动员机制也 会不同 。初步的研究表明 ,VEGF 和 GM - CSF 对血管内 皮祖细胞有动员作用 。 Takahashi 等 [6 ]观察了内源性刺激 (组织缺血) 和细 胞因子 GM - CSF 对血管内皮祖细胞的动力学影响及 其对缺血组织血管新生的作用 。结果发现 ,在兔和鼠的 局部缺血模型中 ,随着组织缺血程度的进展 ,动物外周 血中的血管内皮祖细胞比例逐渐升高 。在小鼠模型 ,缺 血诱导的内皮祖细胞动员明显增强了小鼠角膜损伤的 血管新生 。在兔后腿缺血模型中 ,经 GM - CSF 处理后 , 外周血内皮祖细胞比例显著增加 , 与此相应的缺血组 织血管新生也更加明显 。应用转基因骨髓移植模型 ,进 一步证明了缺血和 GM - CSF 动员的内皮祖细胞可直 接参与血管新生 。由此证明 ,骨髓来源的血管内皮祖细 胞可由缺血和外源性细胞因子 GM - CSF 动员到外周 血 ,并参与缺血组织的血管生成 。 VEGF 是目前最强的促血管形成因子 ,因而在多项 研究中 , VEGF 用于严重缺血肢体的治疗 。最近 , Kalka 等 [7 ]在 VEGF 转基因治疗肢体缺血的研究中 ,发现随着 VEGF 表达水平的增加 , 外周血内皮祖细胞增加了 30 倍之多 。这不仅说明了肢体缺血组织的血管发育不限 于 angiogenesis , 还包括 vasculogenesis 模式 , 也证明了 VEGF 对骨髓源性内皮祖细胞有很强的动员作用 。但这 些研究尚不能说明在其他病理状态下血管母细胞的动 员机理 , 尤其是在肿瘤血管新生过程中血管内皮祖细 胞的动员机理有待进一步研究 。 4 血管内皮祖细胞的分离纯化和培养