土壤放线菌分离方法的初步研究

土壤放线菌分离方法的初步研究

摘要：为了提高从土壤中分离放线菌的效率，解决土壤中的细菌对放线菌分离培养中的污染问题，研究了自然风干、重铬酸钾、青霉素和干热处理4种方法对细菌及放线菌的作用，并对其细菌和放线菌菌落数进行统计。结果表明: 土样放置6 d和21d适合放线菌的分离；用加50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素的培养基，可以选择性地从土壤中分离放线菌；土样在80℃下干热处理也可提高放线菌的分离效率。

关键词：土壤放线菌；分离；风干时间；重铬酸钾；青霉素；干热处理

Preliminary Studies on the Isolation Methods of Actinomycetes from Soil Abstract：In order to improve the efficiency of isolating actionmycetes from soil and solve the problem of contamination by bacteria when actionmycetes were isolated and cultivated, the effect of natural air-dry time, potassium dichromate(K2Cr2O7), penicillin and heat treatment of fabrics on bacteria and actionmycetes was studied in this article, and the number of bacteria and actinomycetes colonies separated f rom soil samples.The result showed tha:6 or 21 days of air-dry is optimal for actionmycetes separation from soil sample; The numder of actionmycetes can be selectively isolated by using a special medium contanting 50 mg/L potassium dichromate or 1 mg/L penicillin; Treating the soil samples with at 80℃ can also promote the efficiency of isolating actinomycetes. Keywords: soilactinomyeetes; isolation; air-drytime; potassiumdichromate(K2Cr2O7); penicillin;heat treatment of fabrics

引言

土壤放线菌是具有巨大应用价值的微生物类群。自Wakksman和Umezwa发现放线菌用途的多样性后，人们还发现放线菌可作为抗生索、维生素、酶和酶抑制剂的产生菌[1]。迄今为止，微生物产生的2万多种生物活性物质(如抗生素等)，有近60％～80％是放线菌产生的。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。从放线菌中筛选新抗生素已成为目前研究的重要课题之一。放线菌大量存在于土壤中,从土壤中分离、纯化、快速筛选目标放线菌是抗生素开发、应用的基础。对于刚采集的土壤样品,细菌和真菌的含量多而放线菌又长势缓慢,不利于放线菌的分离[2]。所以，应尽可能从土壤中分离出放线菌，排除其他微生物如细菌的干扰，创造有利于放线菌生长的条件[3]。为此，笔者就如何抑制土壤其它杂菌的污染

和如何选择抑制剂进行了初步研究，以寻求既能抑制细菌生长，同时又不影响放线菌生长的分离方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1土壤样品2010年7～9月采集于河南农业大学小花园10～20cm深层土[4]，混合，过筛。

1.1.2供试药品与试剂重铬酸钾、青霉素、可溶性淀粉、琼脂、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·4H2O。

1.1.3 仪器全自动蒸汽灭菌器(日本AL P ,CL-32L) ；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司,DHG-9240A)；超净工作台(苏州净化设备有限公司, SW-CJ- 2FD)；智能生化培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂,SP-150)；托盘电子分析天平(岛津国际贸易有限公司,A Y-220) 。

1.1.4培养基（高氏一号合成培养基）

可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCL0.5g/L、10% FeSO4·4H2O溶液2滴、琼脂15~20g。用少量蒸馏水将淀粉溶解并加热至60~70℃使淀粉呈透明状，然后倒入煮沸的培养基中，调pH 至7.4～7.6[5]。

1.2方法采用稀释平板法:将土样制成10-2、10-3、10-4 、10-5 的土壤稀释液。分别取10-2、10-3、10-4 、10-5的土壤稀释液0.2 mL加入已做好的培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释液均匀地涂布整个平板，放入28 ℃恒温培养箱中培养，每个浓度设2个重复，对照为不作任何处理的土壤样品[2]。

2 结果与分析

2.1 土样自然风干对放线菌计数的影响

土样一般都要放置一定时间，再做分离，这样可以减少耗费、提高放线菌检出的效率[2]。按照上述放线菌的分离与纯化的方法做土样放置第0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d的重复试验,统计出各时间段土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。

在高氏一号培养基上，采用稀释平板法分离土壤样品,观察各类微生物出现的情

况:10-2稀释度平板上分离到的菌株多,但生长密集或连成片的较多，挑菌有些困难；10-3稀释度的土壤稀释液放线菌分离效果好,平板上的菌落数适中，细菌生长密集；10-4稀释度的土壤稀释液细菌分离效果好,平板上的菌落数适中；10-5稀释液平板上很少甚至没有。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计，结果见表1。

表1 土样放置不同时间对微生物菌落数的影响

细菌（10-4）340 88 97 171 151 212 139 91 127 114 放线菌（10-3）32 23 53 75 56 60 57 54 31 27 从放置0d的新鲜土样到放置27d的土样统计结果来看，放置0d细菌菌落很多，平板菌落密度过高,相邻菌落相连甚至形成片状菌落,严重影响了放线菌菌种的挑取。放置6d的放线菌菌落较多,种类也较齐全，而细菌数量下降较快。土样放置21d ,培养皿内的细菌非常少,且放线菌种类下降不明显，非常适合放线菌分离。而放置27d的土样,细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。由此可见,土样放置6d和21d均适合放线菌的分离,但放置6d的放线菌的种类更多更全，而放置21d的放线菌单菌落更突出。

2.2 重铬酸钾对放线菌计数的影响

按照放线菌的分离与纯化的方法，在高氏一号培养基中加入25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L的重铬酸钾，统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计,结果见表2。

表2 重铬酸钾对微生物菌落数的影响

从土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数的统计结果来看，无论是任何含量的重铬酸钾,细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。在含25mg/L重铬酸钾的平板上放线菌菌落较多，但细菌菌落也很多,平板菌落密度过高,影响了放线菌菌种的挑