转基因植物中基因沉默的机制与解决方法

转基因植物中基因沉默的机制与解决方法组长：费京珂组员：王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯
（北京化工大学，生命科学与技术学院）
【摘要】近些年，随着植物基因工程的不断发展，转基因后的基因沉默现象也越来越受到人们的关注，为了使得转入的基因能够高效表达且起到相应的功能作用，我们就基因沉默的机制进行综述，并阐述对解决方法的最新研究。

【关键词】植物，基因沉默，转录沉默，转录后沉默，irna
【正文】转基因植物中，基因沉默主要存在两种机制，转录中水平上基因沉默与转录后水平上的基因沉默。

涉及到DNA启动子甲基化，重复序列，同源序列一起的TGS等内容。

针对基因沉默的机制，经过查找资料，我们提出了相应的解决方法。

最后，我们要运用基因沉默的机理，进而使得转基因能更加高效。

一．转基因植物沉默机制【1】【2】【3】【4】【5】【6】
为了极大的提高和完善在植物中通过导入外源基因使其获得新性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的,而大量转基因植株不能正常表达,通常并不是由于外源基因的缺失或突变引起,而是基因失活的结果,这种失活现象就是基因沉默。

转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后三个不同的层次上。

发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应(effect position),位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。

当导入的外源基因整合到宿主高度甲基化、转录活性低的异染色区域时，外源基因一般表现沉默。

位置效应引起的基因沉默不需要基因组中有同源序列,而同源依赖的基因沉默有转录水平上的基因沉默(Transcription-al gene silencing, TGS)和转录后水平上的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)两种形式。

转基因沉默的机制是多方面的,转基因的拷贝数、构型及在植物基因组上的结合位点等诸多因素都与沉默有关,外界环境条件如过高的温度、过强的光照也会增加沉默发生的几率。

转录水平上的基因沉默是由于某种原因致使启动子失活,mRNA合成受阻,转录后水平基因沉默表现为启动子是活跃的,但mRNA被降解而不能积累。

1.转录水平基因沉默(TGS,DNA-DNA)机制
1.1位置效应的基因沉默机制
位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。

外源基因进入细胞核后首先整合到染色质上,其整合位点与表达有密切的关系,若整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不能表达;若整合到甲基化程度低、转录活性高的常染色质上,其表达受两侧DNA 序列的影响。

目前通用的转染方法是使外源基因在宿主细胞基因组中随机整合,整合位点周围基因组序列与外源基因能否稳定表达密切相关。

（1）由于高等生物中存在较高的GC碱基对等容线,即GC碱基在DNA序列中占较高的摩尔比,外源基因整合破坏了这种特征性组成,形成一个宿主细胞易于识别的甲基化位点,使外源基因极易在甲基化酶的作用下发生甲基化而失活。

（2）外源基因若插入转录不活跃区域或异染色质区域,通常会融入该区域的染色质结构中,进行较低水平的转录,或发生异染色质化而导致转染的基因沉默。

Iglesias等将T-DNA (Transferred DNA)转入烟草基因组时,稳定表达的基因座位于与核基质结合的AT富含区域,且在端粒附近;而不稳定的表达基因座则位于同臂内异染色质区域和中间区域。

1.2甲基化作用
从目前的报道看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关,由于宿主细胞基因组DNA中不同位点的甲基化程度存在某种平衡,并形成一定的空间结构特点。

一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征,这种破坏后的结构便诱导宿主基因组防御系统,使新整合进去的DNA序列发生不同程度的甲基化,DNA甲基化都是从启动子区域开始的,主要发生在基因5'端启动子区域。

但也有人发现外源基因的甲基化可延伸至3'端。

甲基化通常发生在DNA的GC和CNG序列的C碱基上,C碱基甲基化不是转基因沉默前提,但对维持基因沉默是必需的。

甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MecP2)的结合进而抑制转录,研究还表明,MecP2蛋白结合了包含协同抑制蛋白mSin3A、组蛋白去乙酰基酶HDAC1和HDAC2在内的多蛋白抑制复合物,去乙酰基酶伴随着MecP2结合的mSin3A,通过对组蛋白H3和H4的去乙酰基,阻碍了转基因启动子与转录因子的接触,从而使转录不能够顺利进行。

1.3重复序列、同源序列等引起的TGS
重复序列诱导的基因沉默(repeat induced gene silencing RIGS),重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。

它有顺式失活(cis-inactiva-tion)、反式失活(trans-inactivation)两种作用方式。

(1)顺式失活(cis-inactivation)指相互串联或紧密连锁的重复基因失活;(2)反式失活(trans-inactivation)指由于基因启动子间同源序列相互作用引发的基因失活现象,也指某一基因的失活状态引起同源的等位或非等位基因的失活。

同源的重复序列会产生异位配对(ectopic pairing),导致DNA形成三链或四链结构,使染色体局部构型发生变化,最终导致异染色质化,从空间上阻碍外源基因的转录而导致沉默的发生,同源启动子序列也有可能竞争结合核内转录因子、RNA聚合酶等转录促进因子,由此导致基因间的相互抑制。

进行多个基因转化时,基因启动子间同源序列相互作用,而研究表明,启动子区域只要有90 bp的同源性就能引起反式失活，且反式失活抑制基因表达的程度与两个基因在寄主植物染色体中的相对位置有关。

1.4复杂结构基因引起的TGS
在转基因操作中,使用结构相对复杂的完整质粒导入基因组后,产生的是高拷贝数、高重排频率的转基因植株,外源基因转录的活性及稳定性受到严重影响。

原因在于组织结构复杂的转基因易形成不规则的结构,拥有更多的断裂热点,在与宿主基因组整合的过程中易产生DNA置换、重排,也更易为宿主防御系统所识别。

2.转录后水平基因沉默机制
2.1 RNA阈值模型
RNA阈值模型(RNA threshold model)是1994年由Dougherty等提出的。

他们认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。

监控系统能促使超量表达的mRNA降解,使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。

但Olivier Voinnet等[19]在研究PTGS在植物中的传递时发现,带有和不带有35S启动子的GFP(Green fluorescent pro-tein)基因都能引起沉默。

不带有启动子的GFP基因在植物体中不能进行转录,但也能引起沉默,这对RNA阈值模型提出了质疑,由此可以判断沉默并不一定都是外源基因的过量表达、转录产物的过量积累造成的。

2.2异常RNA模型
鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平,而是有不同于正常mRNA的异常RNA存在,这种异常RNA可以作为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-depended RNA polymerase,RdRp)的模板,从而引发自身及同源序列的降解。

异常RNA的产生原因是多方面的。

如当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或者外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对(Ectopic pairing),进而转录产生异常RNA(AberrantRNA,aRNA)。

外源基因中存在异常结构,如隐秘的旁侧启动子(Cryptic flanking promot-er)或提前终止末端(Premature ter-mination)也可能导致产生aRNA。

aRNA一旦产生并进入细胞质后,就会激活依赖于RNA
的RNA聚合酶(RNA-depended RNApolymerase,RdRp)的活性,RdRp再以aRNA为模板合成大量约25 bp的互补RNA(ComplementaryRNA,cRNA)。

这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构)))dsRNA,而后被双链特异性的RNase识别、降解。

在上述过程中,内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合,并被同时降解。

这样外源基因的导入,会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻,即出现共抑制(Cosuppression)现象。

共抑制是转录后沉默的主要形式。

通过生物技术手段已鉴定了部分生物体中与基因沉默有关的基因,如拟南芥中的sgs-2,粗糙链胞霉中的qde-1(Quelling defective)基因等,通过揭示这些基因编码的蛋白质的功能,为异常RNA模型提供了部分证据。

但也有实验表明,如果将单拷贝的外源基因转入无同源性基因的单倍体植物中以后,也会导致PTGS现象。

这表明,除同源序列之间的异位配对进而产生aRNA外,PTGS的出现可能还另有它因。

2.3 双链RNA模型
Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同,会导致正义RNA和反义RNA的合成。

这些转录产物将形成dsRNA。

核糖核酸酶(Ribonuclease RNA, RNase) III家族中具有特异识别双链RNA的dicer酶,在ATP存在的情况下,逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA,并将RNA降解为19-23 bp的双链小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。

siRNA双链结构解旋并与蛋白质形成蛋白-RNA诱导沉默复合物( RNA-induced silencing complex , RISC)。

RISC在一个ATP的作用下被激活,激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上,并在距离siR-NA 3c端12个碱基的位置切割mRNA,进而使转基因不能表达。

2.4未成熟翻译终止模型
未成熟翻译终止模型(prematureterminate translation model)指出由于任何一类生物细胞都对密码子剂量有一定偏爱性(codon bias),即密码子使用频率与细胞内相应tR-NA丰度是相对匹配的。

个别基因在细胞内的优势表达将造成稀有tRNA的严重缺失,相应氨酰tR-NA的缺失将造成翻译复合体中核糖体的空载,当空载时间过长将会引起相应mRNA的降解,从而造成相应基因的沉默。

降解mRNA片段依然与核糖体相连,此时核糖体A位处于空置状态,并随时准备接受稀有氨酰tRNA,使细胞内稀有氨酰tRNA维持在一个非常低的水平(共抑制状态)。

此模型可以合理地解释RNA特异降解和与共抑制相关的其他现象。

到目前为止,没有一种通用的模型可以解释所有的转基因沉默现象,但各个模型往往突出解释了转基因机制中的某些方面。

二.消除基因沉默的解决方案【7】【7】【8】【9】【10】【11】【12】
解决方案
1. 消除DNA甲基化
DNA甲基化是基因沉默的直接原因,转基因DNA甲基化的程度与基因沉默程度成正相关,因此消除DAN甲基化将有利于基因的表达。

增强子效应:利用具有组织和发育特异性调控作用的增强子能消除DNA甲基化,确保外源基因有效表达.Lichtenstein等人研究发现,免疫球蛋白K链基因的增强子在细胞发育的特定阶段指导该基因区段去甲基化从而启动基因的转录，密码子优化策略:外源DNA序列与植物基因组DNA碱基组成的差异是引发DNA甲基化的重要原因,外源基因由于其碱基组成和整合位点处不同而被识别发生甲基化.因此在遗传转化之前,应对外源基因密码子进行修饰优化,尽量使外源基因组成与受体植物碱基组成相一致,并采用植物偏爱的密码子,以避免被植物的限制修饰系统所识别,当然也可以采用定点插入的方法,将外源基因插入到与其组成相似的染色体区域;3)其他策略:甲基必须在一定的条件下才可以去甲基化,目前人们已经知道,用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用,但由于其价格昂贵,兼有致癌作用,因此使用价值不大;4)有性杂交也可消除甲基化现象.
2.减少重复或同源序列
由于重复和同源序列是植物基因沉默的普遍诱因,所以在构建表达载体时,应尽量使得所设计的序列与内源序列的同源性较低,以减少或避免配对,不同的基因转化时应尽量使用不同的启动子,应使用不同的选择标记标记不同的基因.而且,选用不同的转基因方法可以减少重复或同源序列,基因枪往往与多拷贝整合位点随机性及沉默现象相连,而农杆菌介导法则多表现为低拷贝或单拷贝,应尽量使用农杆菌介导法,但它易受宿主限制,能利用的宿主范围窄.
3.核基质结合序列(matrix attachment regionMAR)
它是染色质上一段特异DNA序列,长度一般为300～1 000 bp,可以与核骨架结合,也称为核骨架结合序列(scaffold attachment region SAR),两个MAR之间的染色质区域可形成一个约5～200bp的DNA环,利用此特性,可把MAR构建到外源基因的两侧,形成MAR-基因-MAR形式,使之在转基因植物染色质区形成独立的区域,以避免位置效应的影响,且有利于转录因子的结合,能提高外源基因的表达水平和稳定性.
4.合理利用增强子
利用具有组织与发育特异性调控作用的增强子是提高外源基因的表达效果的有效措施之一。

现已发现动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段去甲基化,从而启动基因转录。

1988年,Schwechheimer等用烟草烤烟栽培种“沙姆逊”的叶肉原生质体和BMS(B1ackMex-icanSweet)细胞进行悬浮培养,并进行了富含Gln的转录活性结构域、酵母活性转录因子(GAL4)、疤疹单纯病毒蛋白(VP16)的嵌合结构的瞬间表达。

研究结果表明,结构基因上游激活位点的重复序列是强的转录活性所需要的,当GAL4×VPl6嵌合基因的上游激活序列(Up-stream activation sequence,UAS)重复数为8个时,报告基因的活性达到最高水平,在悬浮培养的BMS细胞中插入同源多聚G1n序列能增强转录活性。

Sandhu等报道,豌豆质体蓝素基因(petE)启动子的富含A/T的负调控区域(在距转录启始位点-44到-177处)在转基因烟草的叶片和转基因马铃薯的小块茎中增强了GUS基因的表达水平
2.5在构建外源基因载体时使用强启动子
从番茄中获得了亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase,LAP)基因,该基因在转入番茄和马铃暮的过程中嵌入相应的GUS基因5′非编码区。

结果发现,该5′非编码区的LAP基因上游-317到-3片段具有启动子功能。

因此,在构建外源基因载体时,可先进行预备试验以选择最强的启动子,以利于外源基因在转基因植株中实现高效表达。

5.其他策略
1)为了使植物获得更多的优良性状,人们往往需要一次转入多个基因或进行多次转化,研究表明,多个基因如果要实现共表达,首先要实现共整合,因此,我们应尽量提高共整合的频率来实现共表达,利用特异性重组系统可将外源基因整合到特定位点上,减少外源基因的随机整合,避免位置效应,使用诱导型启动子能够提高外源基因表达,已有人在转基因水稻植株中获得了ABA胁迫诱导的uidA基因的表达;4)消除反义RNA:不正常的通读会形成反义RNA,因此构建载体时最好将DNA序列顺序排列,避免产生反义RNA.
具体实例【13】【14】【15】【16】
SAR 是染色质被限制性内切酶消化仍与核骨架结合的DNA 序列, 位于染色体的端粒附近。

长度一般为30～1000bp,属于非编码序列,通常富含AT( A T> 70% )。

每个SAR片段中都含有几个序列基元, 如A- bo xes, T-box es。

一定数目的重复基元才能保证SAR与核骨架的特定蛋白有效地结合, 而且这种结合是特异性的。

SAR使转基因高效表达，1996年,Allen 等人用基因枪法进行烟草转化。

他们发现GUS 基因两侧加上SAR,可使其表达活性比对照提高140倍, 但并不能消除转化体间的变异。

这个试验是用基因枪直接转化烟草,它涉及到比农杆菌更复杂的转化模式。

在转化程中,外源DNA 成簇地整合并以多种方式发生重排,所以转化体中目的基因是多拷贝的。

同源序列的相互作用使基因沉默的频率很高,而SAR的加入可使转基因免受异位配对或其他同源序列相互作用的影响, 从而降低同源依赖性基因沉默
的概率。

SAR使转基因稳定表达Peter 等人在农杆菌介导的烟草转化试验中发现,SAR可以使转基因表达水平正常化。

含有SAR片段的转化体与对照相比,变异幅度降低了20倍, 但基因的表达水平没有显著提高。

由此,他们称SAR是一个“绝缘因子”,能够使转基因的表达水平与内源基因一致。

MOM是一种编码核蛋白的基因,参与染色质重构(remodelling) 。

已有报道用突变MOM 基因或通过其反义RNA的表达来消除MOM的转录本,可以使几种已经沉默的高度甲基化的位点恢复转录活性,而这些被恢复的位点可以维持9 代。

发现新近拟南芥TGS水平沉默的释放有两个水平,一个是依赖甲基化水平,即DDM1突变株表现出的去甲基化,另一个是不依赖甲基化水平,即MOM1 突变株表现出的不影响甲基化。

两者的关系是,后者是对前者的加强,尤其在甲基化缺失时,防止外遗传失控的情况出现[。

再次证实去除MOM,确实能够消除TGS水平的沉默现象。

在病毒与植物长期的协同进化过程中,植物通过PTGS机制对病毒产生抗性,而病毒也进化出抑制PTGS的蛋白抑制因子,能抑制PTGS的启动和保持以及传导。

因此,一些病毒的蛋白因子可以用来抑制植物转基因沉默。

烟草蚀刻病毒蛋白(HC - Pro)，Kristin等1998 年发现了这种植物基因沉默抑制子,目前已从多方面的实验证明了其对基因沉默的抑制作用。

基因沉默的病毒抑制子包括:烟草蚀刻病毒基因组RNA 编码蛋白P1 的 5 端区域,HC -Pro 蛋白(由马铃薯Y病毒、水稻斑驳病、南方菜豆花叶病毒和非洲木薯花叶双生病毒编码)以及蛋白P3 的一小部分,因此被叫做P1/ HC - Pro序列。

黄瓜花叶病毒蛋白(CMV2b)，转GFP烟草实验证实:CMV2b的表达,可以导致GFP基因沉默后的叶片在生长点处有GFP的重新表达。

而在旧有的叶片组织中,由于在病毒浸染前已经诱导产生了RNA 沉默,因此不能重新出现GFP的表达。

由此可见,CMV2b 作为病毒抑制子,可以有效地抑制系统沉默信号传递到新生组织中,因此抑制新生组织的基因沉默。

进一步研究发现,外部信号进入CMV2b表达的细胞内并不能有效地触发对目标RNA 的降解。

另外,CMV2b 抑‘D7 制
可影响信号的活性,同时干涉核内aDNA 的甲基化。

但是CMV2b 对细胞内基因沉默的抑制是不完全的,它并不阻止转入的GUS基因沉默的产生,它只阻止转录后基因沉默在细胞内的传递和信号的调节
三.基因沉默的应用
RNAi沉默技术在植物抗病性遗传改良中的应用
1.植物真菌病害的抗性改良
通过表达白粉病菌致病因子Avralo的RNA同源序列，转基因植物表现出对白粉病的抗性c23I。

其机制是植物dsRNA分子可能进入了病原真菌体内，从而导致了真菌基因的沉默(HIGS)。

这一结果提供了一个基于RNAi的植物抗真菌病害遗传改良新策略。

2.植物病毒病害的抗性改良
水稻条纹叶枯病(RSV)CP、SP和CP／SP蛋白、水稻矮缩病毒(RDV)Pnsl2蛋白、玉米矮花叶病毒(MDMV)CP蛋白、菜豆金黄花叶病毒(BGMV)复制起始因子ACl基因沉默／抑制后，转基因植株对病毒病抗性明显提高。

不同编码基因沉默导致的病毒抗性是有明显差异的，靶基因的选择至关重要。

例如RSV编码蛋白pC3和运动蛋白pⅨ沉默转基因植株表现高抗，而编码糖蛋白pC2和无结构蛋白p4的沉默对抗性没有影响。

病毒诱导的基因沉默(vIGS)常受限于病毒的寄主范围。

因此，直接喷洒原核表达的siRNAs也可诱导植物基因沉默，如在接种病毒前5 d，喷洒辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)和李痘疱病毒(PPV)的dsRNA，可成功诱导相关基因的沉默，产生对病毒侵染的抗性。

3．植物线虫病害的抗性改良
表达根结线虫基因dsRNA序列的烟草对根结线虫的抗性高达95％以上。

表达线虫16DlO基因dsRNA序列的拟南芥抑制了线虫虫瘿的形成、减少了虫卵产生；转基因植株对其他种线虫也具有一定的抗性。

【结束语】外源基因沉默阻碍了植物转基因技术在生产上的广泛应用，深入了解外源基因沉默的机制以提高基因表达效率，是顺利开展植物基因工程的迫切需要。

随着分子生物学技术的发展，各领域的研究结果均表明，各种基因沉默现象之间有着广泛的联系，并交织融合成为一个完整的、统一的理论体系，尤其是RNAi 技术出现之后，又使基因沉默分子机理
的研究更进一步，RNAi 技术本身又进一步向人们预示了基因沉默机制在整个生物界的普遍性及其深刻的生物学意义和广泛的应用价值。

希望通过在能完善的解决基因沉默为我们带来的困扰之上，我们能更多的利用基因沉默，来为我们谋求更多的益处，从而让这一领域能够达到新的层次。

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