转基因植物中基因沉默的机制与解决方法

转基因植物中基因沉默的机制与解决方法组长：费京珂组员：王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯

（北京化工大学，生命科学与技术学院）

【摘要】近些年，随着植物基因工程的不断发展，转基因后的基因沉默现象也越来越受到人们的关注，为了使得转入的基因能够高效表达且起到相应的功能作用，我们就基因沉默的机制进行综述，并阐述对解决方法的最新研究。

【关键词】植物，基因沉默，转录沉默，转录后沉默，irna

【正文】转基因植物中，基因沉默主要存在两种机制，转录中水平上基因沉默与转录后水平上的基因沉默。涉及到DNA启动子甲基化，重复序列，同源序列一起的TGS等内容。针对基因沉默的机制，经过查找资料，我们提出了相应的解决方法。最后，我们要运用基因沉默的机理，进而使得转基因能更加高效。

一．转基因植物沉默机制【1】【2】【3】【4】【5】【6】

为了极大的提高和完善在植物中通过导入外源基因使其获得新性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的,而大量转基因植株不能正常表达,通常并不是由于外源基因的缺失或突变引起,而是基因失活的结果,这种失活现象就是基因沉默。转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后三个不同的层次上。发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应(effect position),位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。当导入的外源基因整合到宿主高度甲基化、转录活性低的异染色区域时，外源基因一般表现沉默。位置效应引起的基因沉默不需要基因组中有同源序列,而同源依赖的基因沉默有转录水平上的基因沉默(Transcription-al gene silencing, TGS)和转录后水平上的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)两种形式。

转基因沉默的机制是多方面的,转基因的拷贝数、构型及在植物基因组上的结合位点等诸多因素都与沉默有关,外界环境条件如过高的温度、过强的光照也会增加沉默发生的几率。转录水平上的基因沉默是由于某种原因致使启动子失活,mRNA合成受阻,转录后水平基因沉默表现为启动子是活跃的,但mRNA被降解而不能积累。

1.转录水平基因沉默(TGS,DNA-DNA)机制

1.1位置效应的基因沉默机制

位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。外源基因进入细胞核后首先整合到染色质上,其整合位点与表达有密切的关系,若整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不能表达;若整合到甲基化程度低、转录活性高的常染色质上,其表达受两侧DNA 序列的影响。目前通用的转染方法是使外源基因在宿主细胞基因组中随机整合,整合位点周围基因组序列与外源基因能否稳定表达密切相关。（1）由于高等生物中存在较高的GC碱基对等容线,即GC碱基在DNA序列中占较高的摩尔比,外源基因整合破坏了这种特征性组成,形成一个宿主细胞易于识别的甲基化位点,使外源基因极易在甲基化酶的作用下发生甲基化而失活。（2）外源基因若插入转录不活跃区域或异染色质区域,通常会融入该区域的染色质结构中,进行较低水平的转录,或发生异染色质化而导致转染的基因沉默。Iglesias等将T-DNA (Transferred DNA)转入烟草基因组时,稳定表达的基因座位于与核基质结合的AT富含区域,且在端粒附近;而不稳定的表达基因座则位于同臂内异染色质区域和中间区域。1.2甲基化作用

从目前的报道看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关,由于宿主细胞基因组DNA中不同位点的甲基化程度存在某种平衡,并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征,这种破坏后的结构便诱导宿主基因组防御系统,使新整合进去的DNA序列发生不同程度的甲基化,DNA甲基化都是从启动子区域开始的,主要发生在基因5'端启动子区域。但也有人发现外源基因的甲基化可延伸至3'端。甲基化通常发生在DNA的GC和CNG序列的C碱基上,C碱基甲基化不是转基因沉默前提,但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MecP2)的结合进而抑制转录,研究还表明,MecP2蛋白结合了包含协同抑制蛋白mSin3A、组蛋白去乙酰基酶HDAC1和HDAC2在内的多蛋白抑制复合物,去乙酰基酶伴随着MecP2结合的mSin3A,通过对组蛋白H3和H4的去乙酰基,阻碍了转基因启动子与转录因子的接触,从而使转录不能够顺利进行。

1.3重复序列、同源序列等引起的TGS

重复序列诱导的基因沉默(repeat induced gene silencing RIGS),重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活(cis-inactiva-tion)、反式失活(trans-inactivation)两种作用方式。(1)顺式失活(cis-inactivation)指相互串联或紧密连锁的重复基因失活;(2)反式失活(trans-inactivation)指由于基因启动子间同源序列相互作用引发的基因失活现象,也指某一基因的失活状态引起同源的等位或非等位基因的失活。同源的重复序列会产生异位配对(ectopic pairing),导致DNA形成三链或四链结构,使染色体局部构型发生变化,最终导致异染色质化,从空间上阻碍外源基因的转录而导致沉默的发生,同源启动子序列也有可能竞争结合核内转录因子、RNA聚合酶等转录促进因子,由此导致基因间的相互抑制。进行多个基因转化时,基因启动子间同源序列相互作用,而研究表明,启动子区域只要有90 bp的同源性就能引起反式失活，且反式失活抑制基因表达的程度与两个基因在寄主植物染色体中的相对位置有关。

1.4复杂结构基因引起的TGS

在转基因操作中,使用结构相对复杂的完整质粒导入基因组后,产生的是高拷贝数、高重排频率的转基因植株,外源基因转录的活性及稳定性受到严重影响。原因在于组织结构复杂的转基因易形成不规则的结构,拥有更多的断裂热点,在与宿主基因组整合的过程中易产生DNA置换、重排,也更易为宿主防御系统所识别。

2.转录后水平基因沉默机制

2.1 RNA阈值模型

RNA阈值模型(RNA threshold model)是1994年由Dougherty等提出的。他们认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解,使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。但Olivier Voinnet等[19]在研究PTGS在植物中的传递时发现,带有和不带有35S启动子的GFP(Green fluorescent pro-tein)基因都能引起沉默。不带有启动子的GFP基因在植物体中不能进行转录,但也能引起沉默,这对RNA阈值模型提出了质疑,由此可以判断沉默并不一定都是外源基因的过量表达、转录产物的过量积累造成的。

2.2异常RNA模型

鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平,而是有不同于正常mRNA的异常RNA存在,这种异常RNA可以作为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-depended RNA polymerase,RdRp)的模板,从而引发自身及同源序列的降解。异常RNA的产生原因是多方面的。如当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或者外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对(Ectopic pairing),进而转录产生异常RNA(AberrantRNA,aRNA)。外源基因中存在异常结构,如隐秘的旁侧启动子(Cryptic flanking promot-er)或提前终止末端(Premature ter-mination)也可能导致产生aRNA。aRNA一旦产生并进入细胞质后,就会激活依赖于RNA