东北红豆杉的愈伤组织诱导
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第 13 卷 第 3 期 2011 年 5 月
大连民族学院学报 Journal of Dalian Nationalities University
文章编号：1009 － 315X（2011）03 － 0256 － 04
Vol． 13，No． 3 May 2011
东北红豆杉的愈伤组织诱导
高明波 a，b ，李兴泰 a ，阮成江 a，b
258
大连民族学院学报
第 13 卷
1． 2． 3 愈伤组织继代
东北红豆杉不同外植体愈伤组织诱导情况见
愈伤组织继代周期为 30 d / 代。继代时使用 表 2。
无菌手术刀切下无褐化的新鲜愈伤组织，接种至
表 2 东北红豆杉不同外植体愈伤组织诱导率 %
新的培养基表面。继代培养基同诱导愈伤组织的 培养基相同。
目前市售的 紫 杉 醇 按 原 料 来 源 不 同，一 般 分 为两类： 一类是直接从红豆杉植物中提取； 另一类 为半合成紫杉醇，即从红豆杉嫩枝条或树叶等可
收稿日期：2010 － 12 － 07； 最后修回日期：2011 － 03 － 01 基金项目：大连民族学院青年科研基金项目（ 2009A202） 。 作者简介：高明波（ 1974 － ） ，女，山东莱阳人，讲师，博士，主要从事植物细胞工程研究。
100
─
75． 0
说明： 0 为该处理外植体严重褐化或染菌，没有愈伤组织产生，在 2． 2 计算总诱导率时未记在内。
本 试 验 中，2，4 － D 2． 0 mg · L － 1 ，KT 0． 1 mg·L － 1 系以东北红豆杉茎为外植体诱导愈伤组
织最佳的激素配比，茎直接诱导和经低温处理 3 d
后诱导的诱导率均达 100 % ，愈伤生长情况分别 如图 2、图 3。其次依次为 2，4 － D 1． 0 mg ·L －1， 6 － BA 1． 0 mg·L －1； 2，4 － D 1． 0 mg·L － 1 ，KT 1． 0 mg·L － 1 。对于茎愈伤的诱导，最不适合的激素配 比为 2，4 － D 1． 0 mg·L － 1 ，6 － BA 2． 0 mg·L － 1 ， 其次为 2，4 － D 1． 0 mg·L － 1 ，KT 1． 0 mg·L － 1 。
的褐化情况，但却降低了愈伤组织诱导率。在愈伤组织及培养基中未检测到紫杉醇。
关键词：东北红豆杉； MS 培养基； 愈伤诱导
中图分类号：Q813． 11
文献标志码：A
Calli Induction of Taxus Cuspidata
GAO Ming － boa，b，LI Xing － taia，RUAN Cheng － jianga，b
第3 期
高明波，等： 东北红豆杉的愈伤组织诱导
257
再生资源中提取 10 － 去乙酰巴卡亭Ⅲ，或用提取 紫杉醇过程中的副产物如 7 － 木糖紫杉醇、10 － 去 乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱等为原料经化学半合成 生产紫杉醇或多烯紫杉醇［4］。
采用植物细胞培养技术生产紫杉醇具有很大 潜力。植物细胞培养生产次生代谢产物的基本方 法如图 1［5］。首先筛选含有目标次生代谢物的植 物及最好的基因型，选择合适的部位作外植体进 行愈伤组织诱导。在愈伤诱导过程中筛选合适的 生长培养基，进行传代培养，再经过多代培养，得 到稳定生产的细胞系。然后从多个细胞系中筛选 生长和生产状况最好的稳定的细胞系，对之进行 生物合成途径、诱导、固定化及基因修饰等方面的 研究，最终在反应器中进行放大生产，以及过程工 程调控。
叶为 0． 006 0 % 。因茎和叶中均含有紫杉醇，故 有一定程度的降低，这与文献报道有所不同。
均被选为外植体来诱导愈伤组织，期望获得含有 2． 3 东北红豆杉不同激素处理茎愈伤组织诱导
紫杉醇的愈伤组织进而建立液体悬浮细胞系。
率比较
2． 2 东北红豆杉不同外植体愈伤组织诱导率
东北红豆杉不同激素处理茎愈伤组织诱导情
取东北红豆 杉 新 生 茎 和 幼 嫩 叶 片，按 照 以 下 程序，在诱导接种前进行表面消毒： 自来水反复冲 洗茎和叶片 3 ～ 4 h； 75 % 乙醇浸泡茎和叶片 30 s； 取出茎和叶片，用无菌水浸泡 5 ～ 6 次，洗去表面 乙醇； 用 0． 1 % 升汞浸泡茎和叶片，茎泡 15 min， 叶片泡 10 min； 用无菌水将茎和叶片反复浸泡洗 涤 8 次，洗净表面消毒液； 取出进行过表面消毒并 洗涤过的茎和叶片于灭菌后的培养皿中，用无菌 剪刀将其剪成 1 cm 长的小段（ 茎） 或 1 cm2 的小 块（ 叶片） ，以备接种用。接种时，将剪好的茎和叶 片贴服接种于固体培养基表面，每瓶培养基表面 均匀排布 4 个茎段或叶片，每个激素浓度接种 10 瓶。
HPLC 条件： Agilent 1100，Hypersil ODS C18 柱 （ 4． 6 mm × 250 mm ，5 μm） ； 流动相： V（ 乙腈） ∶ V （ 水） = 52 ∶ 48，流 速 1 mL · min － 1 ，检 测 波 长 227 nm，进样量 10 μL。 1． 2． 2 东北红豆杉愈伤组织诱导
植物细胞培养生产次生代谢产物是有效利用 植物资源生产药物的潜在技术。但产率偏低一直 是制约该项技术实现产业化的瓶颈。要有效提高 次生代谢物的产量，需要综合考虑多方面的因素， 有时需将 多 种 方 案 综 合 使 用 才 能 达 到 理 想 的 效 果［6 － 8］。首先就是外植体的选择。不同外植体诱 导愈伤组织的能力和诱导的愈伤组织合成次生代 谢产物的能力均不同。选择外植体时应考虑到外 植体部位、取材季节、器官生理状态和发育年龄以 及外植体的大小等。本实验即希望在红豆杉愈伤 组织诱导的外植体选择及处理环节上给出有意义 的结果。
Abstract： Taxol of stems and leaves of Taxus cuspidata has been extracted and determined， which shows that both stems and leaves contain trace taxol，while the content of stems is a little higher than that of leaves． Taken stems and leaves as explants，and taken MS basal media as media，ten kinds of hormone combinations have been applied to induce calli in dark． According to the calli inductivity，calli vegetative state，and browning degree during the calli subculture， 2，4 － D 1． 0 mg·L －1 and 6 － BA 1． 0 mg·L －1 are the best hormone combination to induce and subculture calli from stems of T． cuspidata． Low temperature pretreatment is good to alleviate browning of calli，while reduces the calli inductivity． Taxol is not detected in the calli and media． Key words： Taxus cuspidata； MS media； calli induction
1． 0 － F
2． 0 － B
2． 0 － G
KT
0． 1 － C
KT
0． 1 － H
0． 5 － D
0． 5 － I
1． 0 － E
1． 0 － J
培养基在高温灭菌前均调 pH = 5． 8，115℃ 高 压灭菌 15 min。外植体接种后，置于黑暗条件下 诱导，培养室温度（ 25 ± 2） ℃ 。诱导后，每天观察 有否 污 染 及 出 愈 情 况，统 计 诱 导 率，并 记 录 愈 伤 组织的颜 色、质 地 及 生 长 状 况。 诱 导 率 计 算 公 式 为： 诱导率 = （ 形成愈伤组织的外植体块数 /总接 种外植体的块数） × 100 % 。
部分幼茎采摘后于 4℃ 冰箱中保存 3 d，按照 以上步骤消毒接种。
东北红 豆 杉 茎 和 叶 片 接 种 于 MS 基 础 培 养 基，蔗糖浓度为 3 % ，琼脂浓度为 0． 7 % ，水解乳 蛋白质量浓度为 600 mg·L － 1 。激素配比见表 1。
表 1 东北红豆杉愈伤诱导中的激素质量浓度 mg·L － 1
2，4 － D 1． 0
2，4 － D 2． 0
图 1 植物细胞培养生产次生代谢产物的基本方法
1 材料与方法
1． 1 材料 东北红豆杉 Taxus cuspidata 在大连化物所园
区内栽培。 1． 2 方法 1． 2． 1 东北红豆杉茎和叶中紫杉醇的提取和检 测
6 － BA
1． 0 － A
6 － BA
（ 大连民族学院 a． 生命科学学院； b． 生物化学工程国家民委 － 教育部重点实验室， 辽宁 大连 116605）
摘 要：提取并检测东北红豆杉茎和叶中紫杉醇的含量，茎和叶中均含有微量紫杉醇，茎中含量稍高一
些。以茎和叶为外植体，MS 为基础培养基，采用 10 种激素配比在黑暗条件下诱导愈伤组织。综合愈伤 组织诱导率、愈伤组织生长状态和愈伤组织传代过程中的褐化情况，2，4 － D 1． 0 mg · L －1 和 6 － BA 1． 0 mg·L －1 为东北红豆杉茎愈伤诱导和传代的最佳激素配比。低温预处理外植体有利于减轻愈伤组织
比较
况见表 3。
表 3 东北红豆杉不同激素处理茎愈伤组织诱导率
%
诱导率
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
常温处理茎
91． 7 58． 3
0
100
100
91． 7
100
100
100
87． 5
低温处理茎
87． 5
Baidu Nhomakorabea
0
100
0
75． 0 75． 0 75． 0
100
0
50． 0
总诱导率
90． 0
─
─
─
90． 0 87． 5 87． 5
植物是天然化合物的宝库，含有大量有用的 次生代谢物质，是人类药物和工业原料的重要来 源。已经有超过 10 万种化合物从植物中分离鉴 定，并且以 每 年 大 约 4 千 种 新 化 合 物 的 速 度 增 加［1］。美国医药市场的药物有 25 % 来自植物［2］。
红豆杉的提取物紫杉醇 （ paclitaxel，Taxol ） 具有独特的抗癌机理，是继阿霉素、顺铂以后国际 市场最畅销的新型抗癌药物，对多种癌症具有良 好疗效且副作用较小。紫杉醇最初从短叶红豆杉
取东北红豆杉茎干粉 2 g，叶干粉 5 g，置于 50 mL 离心管中，加入 8 倍体积分析纯甲醇（ 含体积 比为 0． 01 % 冰 醋 酸） ，超 声 提 取 2 次，每 次 30 min。提取液于 4 000 r·min － 1 下离心 10 min，合 并上清，25℃ 旋转蒸发，定容至 25 mL 色谱纯甲 醇，0． 22 μm 膜过滤备做 HPLC。
2 结果与讨论
外植体
茎
低温处理茎 叶子
愈伤组织诱导率 90． 9
82． 5
1
叶子在 10 种培养基上均基本没有愈伤产生。
2． 1 东北红豆杉茎和叶中紫杉醇的质量分数
茎在 10 种培养基上均有较高的诱导率，总诱导率
东北红豆杉紫杉醇的质量分数： 茎为0． 0081 % ， 为 90． 9 % ，低温处理并没有提高其诱导率，而是
（ T． brevifolia） 树皮中提取［3］，这种树在全世界仅 有 1 千万株左右。在含量最高的树皮中，紫杉醇 的含量也仅有万分之几，1 公斤紫杉醇需要 2 000 ～ 3 000 棵短叶红豆杉的树皮或 1 万多公斤枝叶。 紫杉醇供给问题引起了医药界的广泛关注，资源 不足成为制约紫杉醇临床应用的主要因素。
（ a． College of Life Science； b． Key Laboratory of Biochemical Engineering （ SEAC － ME） ， Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）
大连民族学院学报 Journal of Dalian Nationalities University
文章编号：1009 － 315X（2011）03 － 0256 － 04
Vol． 13，No． 3 May 2011
东北红豆杉的愈伤组织诱导
高明波 a，b ，李兴泰 a ，阮成江 a，b
258
大连民族学院学报
第 13 卷
1． 2． 3 愈伤组织继代
东北红豆杉不同外植体愈伤组织诱导情况见
愈伤组织继代周期为 30 d / 代。继代时使用 表 2。
无菌手术刀切下无褐化的新鲜愈伤组织，接种至
表 2 东北红豆杉不同外植体愈伤组织诱导率 %
新的培养基表面。继代培养基同诱导愈伤组织的 培养基相同。
目前市售的 紫 杉 醇 按 原 料 来 源 不 同，一 般 分 为两类： 一类是直接从红豆杉植物中提取； 另一类 为半合成紫杉醇，即从红豆杉嫩枝条或树叶等可
收稿日期：2010 － 12 － 07； 最后修回日期：2011 － 03 － 01 基金项目：大连民族学院青年科研基金项目（ 2009A202） 。 作者简介：高明波（ 1974 － ） ，女，山东莱阳人，讲师，博士，主要从事植物细胞工程研究。
100
─
75． 0
说明： 0 为该处理外植体严重褐化或染菌，没有愈伤组织产生，在 2． 2 计算总诱导率时未记在内。
本 试 验 中，2，4 － D 2． 0 mg · L － 1 ，KT 0． 1 mg·L － 1 系以东北红豆杉茎为外植体诱导愈伤组
织最佳的激素配比，茎直接诱导和经低温处理 3 d
后诱导的诱导率均达 100 % ，愈伤生长情况分别 如图 2、图 3。其次依次为 2，4 － D 1． 0 mg ·L －1， 6 － BA 1． 0 mg·L －1； 2，4 － D 1． 0 mg·L － 1 ，KT 1． 0 mg·L － 1 。对于茎愈伤的诱导，最不适合的激素配 比为 2，4 － D 1． 0 mg·L － 1 ，6 － BA 2． 0 mg·L － 1 ， 其次为 2，4 － D 1． 0 mg·L － 1 ，KT 1． 0 mg·L － 1 。
的褐化情况，但却降低了愈伤组织诱导率。在愈伤组织及培养基中未检测到紫杉醇。
关键词：东北红豆杉； MS 培养基； 愈伤诱导
中图分类号：Q813． 11
文献标志码：A
Calli Induction of Taxus Cuspidata
GAO Ming － boa，b，LI Xing － taia，RUAN Cheng － jianga，b
第3 期
高明波，等： 东北红豆杉的愈伤组织诱导
257
再生资源中提取 10 － 去乙酰巴卡亭Ⅲ，或用提取 紫杉醇过程中的副产物如 7 － 木糖紫杉醇、10 － 去 乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱等为原料经化学半合成 生产紫杉醇或多烯紫杉醇［4］。
采用植物细胞培养技术生产紫杉醇具有很大 潜力。植物细胞培养生产次生代谢产物的基本方 法如图 1［5］。首先筛选含有目标次生代谢物的植 物及最好的基因型，选择合适的部位作外植体进 行愈伤组织诱导。在愈伤诱导过程中筛选合适的 生长培养基，进行传代培养，再经过多代培养，得 到稳定生产的细胞系。然后从多个细胞系中筛选 生长和生产状况最好的稳定的细胞系，对之进行 生物合成途径、诱导、固定化及基因修饰等方面的 研究，最终在反应器中进行放大生产，以及过程工 程调控。
叶为 0． 006 0 % 。因茎和叶中均含有紫杉醇，故 有一定程度的降低，这与文献报道有所不同。
均被选为外植体来诱导愈伤组织，期望获得含有 2． 3 东北红豆杉不同激素处理茎愈伤组织诱导
紫杉醇的愈伤组织进而建立液体悬浮细胞系。
率比较
2． 2 东北红豆杉不同外植体愈伤组织诱导率
东北红豆杉不同激素处理茎愈伤组织诱导情
取东北红豆 杉 新 生 茎 和 幼 嫩 叶 片，按 照 以 下 程序，在诱导接种前进行表面消毒： 自来水反复冲 洗茎和叶片 3 ～ 4 h； 75 % 乙醇浸泡茎和叶片 30 s； 取出茎和叶片，用无菌水浸泡 5 ～ 6 次，洗去表面 乙醇； 用 0． 1 % 升汞浸泡茎和叶片，茎泡 15 min， 叶片泡 10 min； 用无菌水将茎和叶片反复浸泡洗 涤 8 次，洗净表面消毒液； 取出进行过表面消毒并 洗涤过的茎和叶片于灭菌后的培养皿中，用无菌 剪刀将其剪成 1 cm 长的小段（ 茎） 或 1 cm2 的小 块（ 叶片） ，以备接种用。接种时，将剪好的茎和叶 片贴服接种于固体培养基表面，每瓶培养基表面 均匀排布 4 个茎段或叶片，每个激素浓度接种 10 瓶。
HPLC 条件： Agilent 1100，Hypersil ODS C18 柱 （ 4． 6 mm × 250 mm ，5 μm） ； 流动相： V（ 乙腈） ∶ V （ 水） = 52 ∶ 48，流 速 1 mL · min － 1 ，检 测 波 长 227 nm，进样量 10 μL。 1． 2． 2 东北红豆杉愈伤组织诱导
植物细胞培养生产次生代谢产物是有效利用 植物资源生产药物的潜在技术。但产率偏低一直 是制约该项技术实现产业化的瓶颈。要有效提高 次生代谢物的产量，需要综合考虑多方面的因素， 有时需将 多 种 方 案 综 合 使 用 才 能 达 到 理 想 的 效 果［6 － 8］。首先就是外植体的选择。不同外植体诱 导愈伤组织的能力和诱导的愈伤组织合成次生代 谢产物的能力均不同。选择外植体时应考虑到外 植体部位、取材季节、器官生理状态和发育年龄以 及外植体的大小等。本实验即希望在红豆杉愈伤 组织诱导的外植体选择及处理环节上给出有意义 的结果。
Abstract： Taxol of stems and leaves of Taxus cuspidata has been extracted and determined， which shows that both stems and leaves contain trace taxol，while the content of stems is a little higher than that of leaves． Taken stems and leaves as explants，and taken MS basal media as media，ten kinds of hormone combinations have been applied to induce calli in dark． According to the calli inductivity，calli vegetative state，and browning degree during the calli subculture， 2，4 － D 1． 0 mg·L －1 and 6 － BA 1． 0 mg·L －1 are the best hormone combination to induce and subculture calli from stems of T． cuspidata． Low temperature pretreatment is good to alleviate browning of calli，while reduces the calli inductivity． Taxol is not detected in the calli and media． Key words： Taxus cuspidata； MS media； calli induction
1． 0 － F
2． 0 － B
2． 0 － G
KT
0． 1 － C
KT
0． 1 － H
0． 5 － D
0． 5 － I
1． 0 － E
1． 0 － J
培养基在高温灭菌前均调 pH = 5． 8，115℃ 高 压灭菌 15 min。外植体接种后，置于黑暗条件下 诱导，培养室温度（ 25 ± 2） ℃ 。诱导后，每天观察 有否 污 染 及 出 愈 情 况，统 计 诱 导 率，并 记 录 愈 伤 组织的颜 色、质 地 及 生 长 状 况。 诱 导 率 计 算 公 式 为： 诱导率 = （ 形成愈伤组织的外植体块数 /总接 种外植体的块数） × 100 % 。
部分幼茎采摘后于 4℃ 冰箱中保存 3 d，按照 以上步骤消毒接种。
东北红 豆 杉 茎 和 叶 片 接 种 于 MS 基 础 培 养 基，蔗糖浓度为 3 % ，琼脂浓度为 0． 7 % ，水解乳 蛋白质量浓度为 600 mg·L － 1 。激素配比见表 1。
表 1 东北红豆杉愈伤诱导中的激素质量浓度 mg·L － 1
2，4 － D 1． 0
2，4 － D 2． 0
图 1 植物细胞培养生产次生代谢产物的基本方法
1 材料与方法
1． 1 材料 东北红豆杉 Taxus cuspidata 在大连化物所园
区内栽培。 1． 2 方法 1． 2． 1 东北红豆杉茎和叶中紫杉醇的提取和检 测
6 － BA
1． 0 － A
6 － BA
（ 大连民族学院 a． 生命科学学院； b． 生物化学工程国家民委 － 教育部重点实验室， 辽宁 大连 116605）
摘 要：提取并检测东北红豆杉茎和叶中紫杉醇的含量，茎和叶中均含有微量紫杉醇，茎中含量稍高一
些。以茎和叶为外植体，MS 为基础培养基，采用 10 种激素配比在黑暗条件下诱导愈伤组织。综合愈伤 组织诱导率、愈伤组织生长状态和愈伤组织传代过程中的褐化情况，2，4 － D 1． 0 mg · L －1 和 6 － BA 1． 0 mg·L －1 为东北红豆杉茎愈伤诱导和传代的最佳激素配比。低温预处理外植体有利于减轻愈伤组织
比较
况见表 3。
表 3 东北红豆杉不同激素处理茎愈伤组织诱导率
%
诱导率
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
常温处理茎
91． 7 58． 3
0
100
100
91． 7
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100
100
87． 5
低温处理茎
87． 5
Baidu Nhomakorabea
0
100
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75． 0 75． 0 75． 0
100
0
50． 0
总诱导率
90． 0
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90． 0 87． 5 87． 5
植物是天然化合物的宝库，含有大量有用的 次生代谢物质，是人类药物和工业原料的重要来 源。已经有超过 10 万种化合物从植物中分离鉴 定，并且以 每 年 大 约 4 千 种 新 化 合 物 的 速 度 增 加［1］。美国医药市场的药物有 25 % 来自植物［2］。
红豆杉的提取物紫杉醇 （ paclitaxel，Taxol ） 具有独特的抗癌机理，是继阿霉素、顺铂以后国际 市场最畅销的新型抗癌药物，对多种癌症具有良 好疗效且副作用较小。紫杉醇最初从短叶红豆杉
取东北红豆杉茎干粉 2 g，叶干粉 5 g，置于 50 mL 离心管中，加入 8 倍体积分析纯甲醇（ 含体积 比为 0． 01 % 冰 醋 酸） ，超 声 提 取 2 次，每 次 30 min。提取液于 4 000 r·min － 1 下离心 10 min，合 并上清，25℃ 旋转蒸发，定容至 25 mL 色谱纯甲 醇，0． 22 μm 膜过滤备做 HPLC。
2 结果与讨论
外植体
茎
低温处理茎 叶子
愈伤组织诱导率 90． 9
82． 5
1
叶子在 10 种培养基上均基本没有愈伤产生。
2． 1 东北红豆杉茎和叶中紫杉醇的质量分数
茎在 10 种培养基上均有较高的诱导率，总诱导率
东北红豆杉紫杉醇的质量分数： 茎为0． 0081 % ， 为 90． 9 % ，低温处理并没有提高其诱导率，而是
（ T． brevifolia） 树皮中提取［3］，这种树在全世界仅 有 1 千万株左右。在含量最高的树皮中，紫杉醇 的含量也仅有万分之几，1 公斤紫杉醇需要 2 000 ～ 3 000 棵短叶红豆杉的树皮或 1 万多公斤枝叶。 紫杉醇供给问题引起了医药界的广泛关注，资源 不足成为制约紫杉醇临床应用的主要因素。
（ a． College of Life Science； b． Key Laboratory of Biochemical Engineering （ SEAC － ME） ， Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）