脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的实验探究

同济医科大学博士学位论空
脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的实验研究同济医科大学附属协和医院神经内科
博士研究生：博士生导师：王耀明
童萼塘教授
中文摘要
第一部分脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的免疫组织化学研究目的采用免疫组织化学的方法，研究脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障（ＢＢＢ）的通透性。

ｆ方法采用线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型，缺血１小时后再灌注，分别于再灌注后Ｏｈ、３ｈ、５ｈ、１２ｈ及２４ｈ，采用免疫组织化学ＳＡＢＣ法，观察内源性免疫球蛋白００９Ｇ）在脑组织中的表达。

结果再灌注ｏｈ、３ｈ时，脑组织中未见ＩｇＧ的表达。

再灌注５ｈ时，缺血侧大脑半球纹状体有局灶性的ＩｇＧ表达。

再灌注１２ｈ时，缺血侧纹状体及新皮层可见有广泛的ＩｇＧ的表达，一些神经细胞和朦＿顺细胞的胞浆内亦有表达。

再灌注２４ｈ时，表达更加明显：】结论缺血ｌｈ再灌注３—５ｈ时，ＢＢＢ开始受损开放，通透性增加。

纹状体的ＢＢＢ较新皮层更易受损。

再灌注１２ｈ、２４ｈ，外渗的血清蛋白存在累积增加。

第二部分尼莫地平对脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的影响目的研究尼莫地平对脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的影响。

ｌ方法采用线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型。

缺血１ｈ后再灌注，分别于缺血前及再灌注后静脉注射尼莫地平。

采用免疫组织化学ＳＡＢＣ法，观察再灌注１２ｈ时．内源性ＩｇＧ在脑组织中的表达，比较缺血前注射尼莫地平组、未注
射尼莫地平组及再灌注后注射尼莫地平组三组大鼠脑组织中ＩｇＧ
的表达水平。

结果末注射尼莫地平组大鼠，在再灌注１２ｈ时，
缺血侧大脑半球纹状体及新皮层可见广泛的ｌｇＧ表达。

再灌注后
注射尼莫地平组大鼠，ＩｇＧ的表达更加明显。

而缺血前注射尼莫
地平组大鼠，ＩｇＧ的表达在新皮层仅见于微血管壁内。

在纹状体
可见局灶性ＩｇＧ的表达。

ｊ结论脑缺血再灌注后注射尼莫地平可
加重ＢＢＢ的损伤，使其通透性增加。

缺血前注射尼莫地平，可
使再灌注后ＢＢＢ的损伤减轻。

第三部分脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的荧光定量分析目的通过敏感的荧光方法，定量分析脑缺血再灌注后大
鼠血脑屏障（ＢＢＢ）的通透性。

防法采用线栓法制备大鼠大脑中
动脉闭塞（ＭＣＡＯ）模型，缺血‰后再灌注，采用依文思兰（ＥＢ）荧
光的方法，分别观察了再灌注２ｈ、３ｈ、９ｈ、２４ｈ和４８ｈ时ＢＢＢ的
通透性。

结果再灌注３ｈ时，缺血侧纹状体ＥＢ的含量开始增加（与
假手术组相比Ｐ＜００５）。

再灌注９ｈ时，缺血侧新皮层ＥＢ的含量开始增加（Ｐ＜０．０１）。

而再灌２ｈ时纹状体ＥＢ的含量和再灌注２ｈ、３ｈ映，新皮层ＥＢ的含量与假手术组相比差别无显著性意义（Ｐ＞ｏ．０５）。

）结
论脑缺血２ｈ再灌注２—３ｈＮ，纹状体的ＢＢＢ通透性开始增加。

再灌注９ｈ时，新皮层的ＢＢＢ通透性增加。

纹状体ＢＢＢ较新皮层更
易受损。

ＥＢ荧光的方法可精确定量的反映ＢＢＢ通透性，是研究
ＢＢＢ通透性理想的方法。

第四部分缺氧预处理对脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的影响目的探讨缺氧预处理对脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障（ＢＢＢ）通透性的影响。

防法大鼠经密闭缺氧的重复作用后，采
用线栓法制备左侧大脑半球局灶性脑缺血模型，缺血２ｈ后再灌
注９ｈ，采用依文思兰（ＥＢ）荧光定量的方法，观察ＢＢＢ的通透性，
并与单纯脑缺血再灌注组和假手术组进行比较。

结果缺氧预
处理组左侧纹状体ＥＢ的含量比单纯脑缺血再灌注组明显减少
（Ｐ＜００１）。

缺氧预处理组左侧新皮层ＥＢ含量比单纯脑缺血再灌注组明显减少（Ｐ＜ｏ０５）：Ｉ结论缺氧预处理对脑缺血再灌注后ＢＢＢ的损伤有保护作用。

第五部分增强ＭＲＪ评价脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障的通透性目的通过增强ＭＲＩ来研究脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障的通透性。

Ｉ方法采用线栓法制备大鼠ＭＣＡＯ局灶性脑缺血再灌注模型。

特别在ＭＣＡＯ３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ后再灌注。

用１．５Ｔ超导型ＭＲ机进行大鼠脑冠状位扫描，随后经股静脉注入Ｇｄ．ＤＴＰＡ，迅速行同层间隙扫描（每隔ｌｏ分钟扫描一次），持续２ｈ。

以双侧对称的脑实质为兴趣区，测得兴趣区信号强度ｆＳｌｌ，求其增强率。

结果ＭＣＡＯ３ｈ组，再灌注８０分钟后缺血侧纹状体明显增强。

４ｈ组，再灌注５０分钟后有明显增强。

５ｈ组，再灌注２０分钟后有明显增强。

６ｈ组，再灌注后即刻可见明显增强。

每组缺血侧侧脑室在再灌注后立即可见明显强化。

１结论脑缺血时间越长，ＢＢＢ通透性增加所需的再灌注时间就越短。

缺血６ｈ再灌注后即刻出现ＢＢＢ破坏。

血脑脊液屏障较早受到破坏。

纹状体区ＢＢＢ比大脑皮层更易受损。

增强ＭＲＩ是一种敏感的在活体条件下检测ＢＢＢ损伤的理想方法。

关键词血脑屏障局灶性脑缺血免疫球蛋白Ｇ尼莫地平依文思兰缺氧预处理磁共振成像大鼠
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｆＢｌｏｏｄ－ＢｒａｉｎＢａｒｒｉｅｒＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｄｕｒｉｎｇＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇＣｅｒｅｂｒａｌＩｓｃｈｅｍｉａ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｏｎＨｏｓｐｉｔａ
ＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ
ＤｏｃｔｏｒａｌＣａｎｄｉｄａｔｅＤｏｃｔｏｒａｌＴｕｔｏｒ：ＷａｎｇＹａｏｍｉｎｇ
Ｐｒｏｆ．ＴｏｎｇＥｔａｎｇ
Ａｂｓｔｒａｅｔ
ＰａｒｔＩ．１ｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅａｌｓｔｕｄｙｏｆｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｄｕｒｉｎｇｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎｉｎｒａｔｓ．
０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｖａｌｕａｔｅｂｌｏｏｄ・ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｄｕｒｉｎｇｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ＭＣＡＯ）ｉｎｒａｔｓｕｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｗａｓｍａｄｅｂｙｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌｎｙｌｏｎｓｕｔｕｒｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ（ＩｇＧ）ｉｎｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｔｉｍｅｐｏｉｎｔ（Ｏｈ，３ｈ．５ｈ，１２ｈ，２４ｈ）ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ１ｈｏｆＭＣＡＯｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ．ＲｅｓｕｌｔｓＩｇＧｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｉｄｎ。

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４
ｅａｓｉｌｙｌｎｓｔｒｉａｔｕｍｔｈａｎｉｎｎｅｏｃｏｒｔｅｘ
ＰａｒｔＩＩ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅｏｎｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ
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Ｐａｒｔ１１１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄ．ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｄｕｒｉｎｇｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎｉｎｒａｔｓｕｓｉｎｇＥｖａｎｓｂｌｕｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ｏｂｊｅｃｔｉｖｅＡｓｅｎｓｉｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｂｌｏｏｄ—ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ）ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｄｕｒｉｎｇｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ＭＣＡＯ）ｉｎｒａｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭａｌｅｗｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｒｅＳＵｂｊｅｃｔｅｄｔｏＩｅｆｔＭＣＡＯｂｙｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌｎｙｌｏｎｓｕｔｕｒｅＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗａｓｐｒｏｄｕｃｅｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇ２ｈｏｆＭＣＡＯＢＢＢｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙＥｖａｎｓｂｌｕｅ（ＥＢ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｉｔｈｅｒ２，３，９，２４ｏｒ４８ｈａｆｔｅｒｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ
５
同济医科太学博士学位论文
ＲｅＳｕＩｔｓＥＢｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｌｅｆｔｓｔｒｉａｔｕｍｆｉｒｓｔｉｎｃｒｅａｓｅｄａｔ３ｈｏｆ
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６
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ＨｙｐｏｘｉａｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇＲａｔ
刖置
脑血管疾病是导致人类死亡的三大疾病之一，在某些地区，其死亡率居于首位。

其中，缺血性脑血管疾病占脑血管疾病发病率的百分之七十。

缺血性脑血管疾病是一类常见的致残率很高的严重威胁人类健康的疾病。

如何对这类疾病进行防治，一直是神经科学工作者攻关的重点。

脑水肿是脑缺血最主要的病理反应，最初为细胞毒性脑水肿，随后发生血管源性脑水肿。

血管源性脑水肿与血脑屏障（ＢＢＢ）通透性的改变相关。

ＢＢＢ受到缺血性损伤，其通透性增加，血液中的蛋白质等物质就会大量渗出到细胞外间隙，引起水分在细胞外间隙内的潴留，从而发生血管源性脑水肿，加重脑损伤。

因此，研究脑缺血后ＢＢＢ的通透性对防治缺血性脑水肿具有重要意义。

目前，缺血性脑血管疾病还缺乏一种理想的治疗措施。

多年来，临床神经病学家曾寄希望于缺血早期使用溶栓药物重建缺血区血供，以减少脑损伤，改善预后。

然而，６０年代末至７０年代溶栓治疗的结果表明，颅内出血率太高，因而溶栓治疗被摒弃。

近年来，由于对脑梗塞病理生理研究的深入，心肌梗塞溶栓的成功经验以及新溶栓药物的问世，唤起了人们对此疗法的重新关注。

大量的研究证明，血管闭塞３～６小时内恢复血流，脑梗塞还可能被挽救，超过这段时间后恢复血流，不但难于挽救脑细胞，还可能引起再灌注损伤，继发出血、脑水肿，这段时间称为复流治疗时间窗。

溶栓治疗后导致出血性改变的确切机制尚不清楚．可能的原因有：（１）缺血后血管壁的损伤；（２）继发性纤溶及凝血障碍；（３）卒中后期ＢＢＢ的通透性增加而伴有再灌注出血。

目前，国内外还没有对脑缺血６小时内再灌注后ＢＢＢ通透性进行系统研究的报道。

针对溶栓治疗６小时以内的时间
窗，我们对缺血６小时以内再灌注后ＢＢＢＪ嗵透性的改变进行了研究，这对探讨溶栓导致出血的机制及复流时间窗的确定具有重要的意义。

脑梗塞后及早恢复血流，缩小病灶，促使可逆性损伤的神经元恢复，成为长期研究的热点。

然而，许多观察表明，在缺血持续一定时间后的复流，可加重微循环障碍，出现脑水肿，甚至病灶出血，导致严重后果。

所以，以防治再灌注损伤为中心的脑保护措施，是另一个研究的焦点。

目前，对脑缺血后脑保护的研究较多，而对脑缺血再灌注后ＢＢＢ保护的研究则甚少。

尼莫地平是二氢吡啶类钙拮抗剂，能选择性作用于脑血管。

大量的研究表明，尼莫地平对缺血性神经元的损害有保护作用，其是否对缺血性ＢＢＢ损伤有保护作用，还未见这方面的报道。

众多的研究也表明，缺血、缺氧预处理可触发和提高心肌对缺血、缺氧的耐受性。

由此，我们推测缺血、缺氧预处理也可提高ＢＢＢ对缺血、缺氧的耐受性。

在我们的课题研究中，观察了尼莫地平及缺氧预处理对脑缺血再灌注后ＢＢＢ通透性的影响。

１８８５年Ｅｈｒｌｉｅｈ首先描述了ＢＢＢ现象。

１９２１年Ｓｔｅｒｎ等明确证实了ＢＢＢ的存在。

近２０年来，由于生物膜理论和神经生化迅速发展，特别是电子显微镜、免疫和酶学方法的应用以及神经影像学的发展，对ＢＢＢ的形态和功能的认识提高到了新的水平。

ＢＢＢ的结构基础是脑毛细血管内皮细胞及其紧密连接，这是血脑间交换的第一道屏障。

围绕在脑毛细血管内皮细胞外的基底曦具有连续性，为血脑间的第二道屏障。

脑毛细血管基底膜外面的几乎８５％的内皮细胞表面被神经胶质细胞终足形成胶质膜包绕，这是维持脑内环境恒定的第三道屏障。

ＢＢＢ主要的生理功能是延缓和调节血液与脑脊液、脑细胞外液之间的物质交换，保持脑内环境的稳定。

ＢＢＢ功能的减弱表现为其通透性的增加。

过去对ＢＢＢ通透性的研究多采用定性及半定量的方法。

我们采
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用了三种敏感的研究方法对缺血再灌注后ＢＢＢ的通透性进行了研究。

这三种方法分别为免疫组织化学方法，依文思兰荧光定量分析的方法以及增强ＭＲＩ的方法。

其中，采用后两种方法来研究缺血性ＢＢＢ损伤，国内尚未见报道。

本课题分五个部分完成。

第一部分：脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的免疫组织化学研究。

第二部分：尼莫地平对脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的影响。

第三部分：脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的荧光定量分析。

第四部分：缺氧预处理对脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的影响。

第五部分：增强ＭＲＩ评价脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障的通透性。

本课题研究的目的在于：（１）观察脑缺血ｌ一６小时再灌注后ＢＢＢ通透性的改变。

（２）探讨尼莫地平及缺氧预处理对脑缺血再灌注后ＢＢＢ通透性的影响。

（３）评价三种研究ＢＢＢ通透性的方法。

１０
圈１假手术组大鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色阴性（×１００）
ｍ２脑缺血ｌｈ再灌注３ｈ大鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色阴性（×１００）
１８
圈３脑缺血ｌｈ再璃注５ｈ太鼠纹状体神经纤维碉呈局灶性ＩｇＧ的表达（×１００）
图４脑缺血１ｈ再灌注５ｈ丈鼠纹状体神经纤维罔呈局灶性ＩｇＧ的表达（Ｘ４００）
１９
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图５脑缺ｆｆＴ『ｌｈ再灌注１２ｈ大鼠脑组织的神经纤维网及胞浆内
可见ＩｇＧ免疫组织化学染色（Ｘ４００）
图６脑缺血ｌｈ再灌注２４ｈ丈鼠脑组织可见明显的ＩｇＧ免疫组织化学染色（ｘ４—００）
２０
图Ｉ缺血前用药组大鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色仅见于微血管壁有ＩｇＧ的表达（×１００）
图２缺血前用药组大鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色仅见于微血管壁有ＩｇＧ的表达（Ｘ２００）
图３再灌注后用药组大鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色可见有广泛的ＩｇＧ的表达（ｘ１００）
图４再灌注启用葑组太鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色，可见有广泛的ＩｇＧ的袭达（Ｘ２００）
２８
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图５空白对照组大鼠脑组织１９６免疫组织化学染色，可见有明显的ＩｇＧ的表达（ｘ１００）
图６空白对照组大鼠脑组织ＩｇＧ免疫组织化学染色可见有明显的ＩｇＧ的表达（Ｘ２００）
剁济医科大学博士学位论文
第三部分脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性
的荧光定量分析
刖舌
脑梗塞一开始即给予溶栓治疗，使缺血组织再灌注，这样可减轻缺血性损伤…。

可是，如果再灌注不及时，则会增加出血和加重脑水肿的危险【２】。

ＢＢＢ受到破坏是引起血管源性脑水肿的主要发病机制。

对脑缺血再灌注后ＢＢＢ通透性的研究，目前国内外的报道甚少。

我们采用可逆性线栓法ＭＣＡＯ的大鼠模型，阁敏感的荧光定量方法，对脑缺血再灌注后大鼠ＢＢＢ的通透性进行了研究。

材料和方法
】实验动物分组：健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠４８只，体重为２５０—３５０９，随机分成６组，即缺血２ｈ再灌注２ｈ组、再灌注３ｈ组、再灌注９ｈ组、再灌注２４ｈ组、再灌注４８ｈ组及假手术组。

每组８只大鼠。

２．动物模型的制备：采用改进的Ｎａｇａｓａｗａｔ３１栓线的方法，闭塞左侧ＭＣＡ，造成左侧大脑半球的局灶性脑缺血，缺血２ｈ后，从颈内动脉抽出栓线即造成再灌注。

动物模型成功的标准为：缺血２ｈ后，出现右侧肢体偏瘫，右前肢明显。

动物处死后未见有颅底出血，动脉环无血栓形成。

不符合上述标准的大鼠不作为研究对象。

假手术组不向颈内动脉插栓线，其它操作与脑缺血再灌注组一样。

３．ＢＢＢ通透性的评价：ＢＢＢ的通透佳是按照Ｕｙａｍａ的方法ｆ４Ｊ，通过渗出血管外的ＥＢ（Ｆｌｕｋａ进口分装）来评价的。

在再灌注１ｈ、２ｈ、８ｈ、２３ｈ年ｆ１４７ｈ时麻醉大鼠，经股静脉注Ａ．２％ＥＢ生理盐水溶液（４ｍｌ／ｋｇ）１ｈ后，开胸通过左心室灌注生理盐水（灌注压为
１１０ｍｍＨ９１，直到右，ＩＬ，房流出的液体无色为ＩＥ，断头取脑，分别取双侧背外侧新皮层，双侧纹状体，样本称重并放入５０％ｉ氯乙酸溶液中，匀浆和离心（１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ），取上清液按１３的比例用乙醇稀释。

荧光值通过荧光分光光度计（ＨＩＴＡＣＨＩ６５０－６０）测得ｆ激发波长６２０ｎｍ，发射波长６８０ｎｍ）。

根据ＥＢ溶液（１００—５００ｕｇ／ｍ１）的外在标准绘出的ＥＢ与荧光值之间的线形标准曲线，可以得出脑组织中ＥＢ的含量，并用每克组织含量来表示。

４统计学处理：多组数据间的比较采用Ｆ检验，两组数据问的比较采用ｔ检验。

结果以平均数±标准差（ｘ±ｓ）表示。

结果
ｌ纹状体ＥＢ含量：缺血２ｈ再灌注２ｈ时，缺血侧纹状体ＥＢ含量与假手术组相比差别无显著性意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。

再灌注３ｈ时，与假手术组相比差别有显著性意义（Ｐ＜００５）。

再灌注９ｈ、２４ｈ时与假手术组相比差别有非常显著性意义（Ｐ＜００１）。

再灌注４８ｈ时，与假手术组相比差别有显著性意义（Ｐ＜０ｏｓ）。

纹状体ＥＢ含量在再灌注２４ｈ时最高。

表１纹状体ＥＢ的含量（ｕｇ＾Ｂ脑组织）
‘Ｐ哪０５・・Ｐ，ａＯ．Ｏｌ与投手术组相比△Ｐ舶０５△△Ｐ＜ｏｏｌ与右删大齄半球相比较
２．新皮层ＥＢ含量：缺血２ｈ再灌注２ｈ、３ｈ时，新皮层ＥＢ含量与假手术组相比差别无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。

缺血再灌注９ｈ、２４ｈ时，与假手术组相比差别具有非常显著性意义（Ｐ＜００１）。

再灌注
４８ｈｈ＂：ｊ＂，与假手术组相比，差别具有显著性意义（Ｐ＜ｏ０５）。

新皮层ＥＢ含量在再灌注２４ｈ时最高。

表２新皮层Ｅ１３的含量（ｕｇｉｇ脑组织）
：Ｐ＜００５・’Ｐ（ｏ０１与侣手术组相比△Ｐ＜００５△△Ｐ＜００１与右侧大脑半球相比段
讨论
脑水肿是缺血性脑血管病主要的临床并发症之一，缺血性脑水肿存在细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿，早期水的积聚被认为是细胞毒性脑水肿。

以后，蛋白渗出微血管外引起液体聚积而产生血管源性脑水肿。

ＥＢ是一种偶氮基荧光染料，它具有能在体外和体内与血清蛋白结合的特性，从而被广泛用来评价ＢＢＢ的通透性。

通过可见的蓝染区域和荧光显微镜下出现的红色荧光，即可定性反映ＢＢＢ的通透性。

渗出血管外的ＥＢ也可通过比色法定量分析…，但ＥＢ比色定量分析存在灵敏性不高的问题，少量渗出的ＥＢ定量分析比较困难。

Ｓａｒｉａｔ６Ｉ证实ＥＢ荧光的方法比比色法敏感１００倍。

比色法所用的是甲酰胺提取技术，而脑在甲酰胺中匀浆呈胶状，上清液不能通过离心取得。

荧光方法是用５０％三氯乙酸提取脑中的ＥＢ，可通过匀浆、离心取上清液，上清液加入乙醇稀释后，可以增加荧光的敏感性和ＥＢ的稳定性。

用ＥＢ荧光豹方法可敏感地检测到脑中ＥＢ的含量，从而精确地反映ＢＢＢ的通透性。

我们的研究发现，再灌注３ｈ、４８ｈ组的纹状体和再灌注４８ｈ的新皮层，都无可见的蓝染区域，但经ＥＢ荧光分析，其ＥＢ的含量仍明显高
于假手术组。

可见ＥＢ荧光的方法可准确地反映ＢＢＢ的破坏程度。

Ｂｅｌａｙｅｖｌ７’采用ＥＢ荧光的方法研究了脑缺血后ＢＢＢ的通透性改变，认为ＥＢ荧光的方法能精确定量的反映局灶性脑缺血时ＢＢＢ的损伤情况。

这种方法可以用来评价对ＢＢＢ起保护作用的药物。

我们的研究还发现，缺血２ｈ再灌注３ｈ时缺血侧纹状体ＢＢＢ开始开放。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｔ８１通过测量脑组织中“Ｃ．蔗糖的方法对大鼠ＭＣＡＯ２ｈ再灌注后３ｈ一１４天ＢＢＢ通透性进行了研究，发现再灌注３ｈ后脑中蔗糖含量增高，说明此时ＢＢＢ通透性增加，这与我们研究的结果是～致的，但他们没有对再灌注３ｈ以前ＢＢＢ通透性进行观察。

目前关于脑缺血再灌注后ＢＢＢ受损的机制还不太清楚，可能存在以下几个方面的机制。

首先，可能与再灌注后显著的反应性充血有关【９Ｊ。

在遭受严重缺血的区域，再灌注后，几乎都会发生反应性充血。

另一种可能的机制是缺血后氧的再供给，氧自由基可引起细胞膜脂质的过氧化，导致膜ＡＴＰ酶的缺乏，同时也会打破离子的平衡以及使游离脂肪酸浓度增加［１０ｌ。

再灌注后还会出现中性粒细胞和巨噬细胞的集聚，以及蛋白酶的释放，这些都会加重ＢＢＢ的损伤…－”ｔ”１。

Ｙａｎｇ［“１认为再灌注后恢复了水和渗透性物质的供给，从而加重脑水肿、脑损伤。

再灌注损伤可能与水肿和梗塞相关的一些生物化学介质的释放有关，其中许多可能是直接从神经元或从内皮细胞中释放出来的，这些介质包括兴奋性氨基酸、缓激肽、组织胺及阳离子等。

也有学者认为［１５１，缺血再灌注后ＢＢＢ的开放是由于酸中毒使微血管的自动调节功能丧失，血管扩张，从而导致再灌注后，过量的血流和过高的血管内压，使内皮细胞的紧密连接增宽以及诱导胞饮的产生。

总之，我们通过ＥＢ荧光的方法定量分析的结果表明，缺血２ｈ再灌注２—３ｈ时，纹状体的ＢＢＢ首先开放。

再灌注９ｈ时，新皮层的ＢＢＢ通透性增加。

纹状体ＢＢＢ较新皮层更易受损。

ＥＢ荧光
塑堑堕登查主堕主兰壁堡兰
的方法可精确定量的反映ＢＢＢ通透性，是研究ＢＢＢ通透性理想的方法。

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同济医科大学博士学位论文
附图脑的依文思兰染色：Ａ为假手术组．未见染色：Ｂ为缺Ｊ加粤灌：ｊ组可见左侧大脏半球有明显的蓝染区域：ｃ为缺最颓处理组．染巴一棚、基
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图ｌ脑缺血３ｈ时大鼠脑懈Ｉ的Ｔ．ｗＩ的表现
无明显信号强度的改变
图２脑缺血３ｈ再灌注后增强脓Ｉ的ＴｌｗＩ的表现
可见缺血侧侧脑室有强化。