流式细胞仪实验方法及常见问题分析
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• 荧光补偿
• 样本收集
• 仪器维护和质控
举例 1 采样软件
举例 2 单参数直Biblioteka Baidu图
举例 3 点图
举例4 凋亡测定
举例5 CBA
间接免疫荧光染色：先用一抗与待测抗原反应，再 用二抗（荧光素标记）进行标记。
选择合适的荧光染料
• 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发。（激 发光源488nm\633nm\407nm） • 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围。 • 荧光素光谱的重叠应当尽量减少。 • 一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制 备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗 体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。
流式细胞仪实验方法及常见问题 分析
• 流式细胞仪（Flow Cytometer）是集多种 技术为一体的新型高科技仪器。
• 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流 式细胞仪为检测手段，对处在快速直线 流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数定量分析和分选的高新技术。 • 研究对象：各种细胞、微生物、人工合 成微球等。
脱落细胞应去除取材伴随的杂质后再制备细胞 悬液。 对临床诊断和治疗很有意义，比如脱落的肺泡 细胞。
④ 新鲜实体组织单细胞悬液制备
常用方法：酶消化法、机械法、化学处理法、表 面活性剂处理法等。 不论哪种方法都不可避免会对细胞表面膜结构、 细胞活性和功能造成不同程度的损伤。
⑤ 活检标本单细胞悬液制备
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打 彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清 改用生物素-亲和素、增加抗体 用量、延长反应时间 改用原位末端标记或Annexin-V 和PI双标记法
二、标记荧光抗体
•
•
直接免疫荧光染色：细胞与抗体反应，多用于细胞 表面标志的染色分析。
方法：与新鲜实体组织基本相同，要求镜检 取材标本至少取3块以上。
⑥ 石蜡包埋组织单细胞悬液制备
常用方法：二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡 法、甲氧-双氧水处理法。 扩大了流式的应用范围，有利于进行临床回 顾性研究。
评判单细胞悬液制备的标准
1. 2. 3. 4. 细胞团块、碎片尽可能少，不能出现肉眼可见的团 块，上机前细胞必须过300目滤膜。 细胞呈单个分散状态。 细胞浓度：5×105~1×106 分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证
影响荧光染色效果的因素
• 温度：高温时荧光淬灭的可能性增大。 • pH值：其改变会导致荧光光谱改变，影响荧光强度。 • 固定剂：与细胞的某些物质结合后，干扰荧光染料与 细胞成分的结合，造成荧光强度改变。 • 其他：孵育时间、溶剂的性质、细胞浓度等。
三、上机检测（老师）
• 设门 • 画图
• 电压调节
在上述信号基础上的细胞分选（未开展分选）
单细胞标本的制备
FCM 实 验 流 程
标记荧光抗体
检 测（老师）
数据分析
一、单细胞标本的制备 （关键步骤）
6种标本来源
① 外周血单细胞悬液制备 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液，需 要用红细胞裂解液裂解RBC。
② 培养细胞的单细胞悬液制备
③ 脱落细胞的单细胞悬液制备
BD FACSAria
• 中心实验室的流式能做什么？ • 流式实验需要做哪些准备和工作？
流式细胞仪检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 染色体分析
细胞功能
特异性抗原（细胞表面/胞浆/核） 细胞活性 细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 凋亡
下一步的荧光染色处理。
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
细胞密度低 非特异荧光强 碎片多 细胞聚集 荧光弱 测不出亚二倍 体峰
原
因
解决对策
增加离心时间、吸弃上清
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
制备过程中细胞损失 抗体不纯、死亡细胞多 细胞死亡、机械损伤 消化不完全、酒精固定 造成的细胞粘连 灵敏度不够、抗体加入 量不饱和、反应时间短 凋亡测试方法选择不当
• 样本收集
• 仪器维护和质控
举例 1 采样软件
举例 2 单参数直Biblioteka Baidu图
举例 3 点图
举例4 凋亡测定
举例5 CBA
间接免疫荧光染色：先用一抗与待测抗原反应，再 用二抗（荧光素标记）进行标记。
选择合适的荧光染料
• 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发。（激 发光源488nm\633nm\407nm） • 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围。 • 荧光素光谱的重叠应当尽量减少。 • 一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制 备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗 体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。
流式细胞仪实验方法及常见问题 分析
• 流式细胞仪（Flow Cytometer）是集多种 技术为一体的新型高科技仪器。
• 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流 式细胞仪为检测手段，对处在快速直线 流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数定量分析和分选的高新技术。 • 研究对象：各种细胞、微生物、人工合 成微球等。
脱落细胞应去除取材伴随的杂质后再制备细胞 悬液。 对临床诊断和治疗很有意义，比如脱落的肺泡 细胞。
④ 新鲜实体组织单细胞悬液制备
常用方法：酶消化法、机械法、化学处理法、表 面活性剂处理法等。 不论哪种方法都不可避免会对细胞表面膜结构、 细胞活性和功能造成不同程度的损伤。
⑤ 活检标本单细胞悬液制备
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打 彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清 改用生物素-亲和素、增加抗体 用量、延长反应时间 改用原位末端标记或Annexin-V 和PI双标记法
二、标记荧光抗体
•
•
直接免疫荧光染色：细胞与抗体反应，多用于细胞 表面标志的染色分析。
方法：与新鲜实体组织基本相同，要求镜检 取材标本至少取3块以上。
⑥ 石蜡包埋组织单细胞悬液制备
常用方法：二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡 法、甲氧-双氧水处理法。 扩大了流式的应用范围，有利于进行临床回 顾性研究。
评判单细胞悬液制备的标准
1. 2. 3. 4. 细胞团块、碎片尽可能少，不能出现肉眼可见的团 块，上机前细胞必须过300目滤膜。 细胞呈单个分散状态。 细胞浓度：5×105~1×106 分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证
影响荧光染色效果的因素
• 温度：高温时荧光淬灭的可能性增大。 • pH值：其改变会导致荧光光谱改变，影响荧光强度。 • 固定剂：与细胞的某些物质结合后，干扰荧光染料与 细胞成分的结合，造成荧光强度改变。 • 其他：孵育时间、溶剂的性质、细胞浓度等。
三、上机检测（老师）
• 设门 • 画图
• 电压调节
在上述信号基础上的细胞分选（未开展分选）
单细胞标本的制备
FCM 实 验 流 程
标记荧光抗体
检 测（老师）
数据分析
一、单细胞标本的制备 （关键步骤）
6种标本来源
① 外周血单细胞悬液制备 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液，需 要用红细胞裂解液裂解RBC。
② 培养细胞的单细胞悬液制备
③ 脱落细胞的单细胞悬液制备
BD FACSAria
• 中心实验室的流式能做什么？ • 流式实验需要做哪些准备和工作？
流式细胞仪检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 染色体分析
细胞功能
特异性抗原（细胞表面/胞浆/核） 细胞活性 细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 凋亡
下一步的荧光染色处理。
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
细胞密度低 非特异荧光强 碎片多 细胞聚集 荧光弱 测不出亚二倍 体峰
原
因
解决对策
增加离心时间、吸弃上清
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
制备过程中细胞损失 抗体不纯、死亡细胞多 细胞死亡、机械损伤 消化不完全、酒精固定 造成的细胞粘连 灵敏度不够、抗体加入 量不饱和、反应时间短 凋亡测试方法选择不当