高效液相色谱法
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习题及解答
选择题：
1. 键合相的键合基团的碳链长度增长后 ( A)C
A.极性减少
B.极性增大
C.载样量增大 D.载样量减少
2. 提高色谱柱柱效的可行方法是 ( AB) CD
A.选择小粒度的固定相 B.降低固定相的粒度分布
C.选择球形固定相 D.匀浆装柱
E.增加柱长
F.选择适宜流动相
G.降低流速
开口毛细管柱 H = B/u + Cu
HPLC：
H = A + Cu
QB2Dm
Dm
T
原因：T↓；η↑； u↑→ 忽略B/u
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二、基本原理
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GC 和 HPLC 的 H-u 图
(1) B/u (2) Cu (3) A (4) HPLC 的uopt (5) GC 的uopt
❖ HPLC：
R n1 k2 4 1k2
▪ α 与固定相性质和流动相种类有关 ▪ k 与流动相配比有关
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五、流动相
❖ 正相洗脱 ❖ 反相洗脱
流动相的极性小于固定相的洗脱 流动相的极性大于固定相的洗脱
❖ 洗脱方式：
等度洗脱(isocratic elution) 恒定配比的溶剂系统洗脱
梯度洗脱(gradient elution) 在一个分析周期内不断改变流动相的比例
了解
•HPLC的特点. •HPLC的仪器 结构及各部件.
熟悉
•HPLC中色谱 条件的选择. •化学键合相 色谱法.
掌握
•范氏方程在 HPLC的表达 形式. •分离度影响 因素 •正相色谱和 反相色谱.
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习题及解答
填空题： 1. 反相色谱中固定相的极性 小于流动相的极性. 2. HPLC中范氏方程的表达式为: _H___=___A__+___C_u_______ 3. HPLC流动相的pH值应控制为__2_-_8_______
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习题及解答
解：（1）
k1ttR '01
tR1t04.1 01.31 2.13
t0
1.31
同理：
k2
4.381.312.34 1.31
k2 2.341.10
k1 2.13
R n1 k2 1.0 4 1k2
（2）
R
2 1
R
2 2
L1 L2
1 .0 2
R
2 2
0 .1 5 0 .3 0
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1. 反相键合相色谱法(RBPC) ▪ 分离机制：疏溶剂理论等 ▪ 固定相：非极性的键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱) ▪ 流动相：极性大的流动相 如:甲醇-水或乙腈-水
▪ 流动相极性与k的关系: 极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 极性大的组分先出柱
▪ 应用：非极性--中等极性组分(80%)
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
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高效液相色谱仪分析流程仿真系 统
分析化学教研室
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高效液相色谱法
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法 4 固定相 5 流动相 6 高效液相色谱仪
小结 习题及解答
一、概 述
❖ 高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的 理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。
•固定液极性 < 流动相极性 •极性大的组分先出柱，极性小的组分 后出柱
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三、各类高效液相色谱法
化学键合相色谱法
(bonded phase chromatography，BPC)
概念：固定液的官能团通过 化学反应键合在载体表面
反相键合相
正相键合相
离子对
离子抑制
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三、各类高效液相色谱法
参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。 其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。
▪ 键合基团键长：键长↑，载样量↑，k↑
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HPLC
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法 4 固定相
5 流动相
6 高效液相色谱仪
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五、流动相
❖ 要求： ▪ 与固定液不反应；对样品有良好溶解度 ▪ 粘度小；与检测器匹配
AGILENT
WATERS
一、概 述
application
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高效液相色谱法
1 概述
2 基本原理
3 各类高效液相色谱法 4 固定相 5 流动相 6 高效液相色谱仪
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二、基本原理
❖ 范氏方程（Van Deemter equation)：重要
GC：
填充柱 H = A + B/u + Cu
4
固定相
5
流动相
6
高效液相色谱仪
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三、各类高效液相色谱法
1
液固吸附色谱法（LSC）
2
液液分配色谱法（LLC）
3
化学键合相色谱法（BPC
）
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三、各类高效液相色谱法
❖ 液固吸附色谱法
▪ 分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活 性中心
▪ 固定相:硅胶 ▪ 流动相:底剂（烷烃）+ 极性调节剂
❖ 简称：HPLC；HRLC；SPLC； UPLC 超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography）
❖ 与经典LC相比——高效 ◇ 高效填料：3～5μm ◇ 高压泵输液 ◇ 高灵敏度的检测器:在线检测
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GC
•能气化、热 稳定性好、且 沸点较低的样 品，占有机物 的20%
φ 1-1.5mm L 10-20cm 常微量柱
▪ 制备柱
φ 20-50mm L 3-25cm
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ▪ 检测器: 1. 紫外检测器 2. 荧光检测器 3. 蒸发光散射检测器 4. 其它检测器
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
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习题及解答
计算题： 1. 用15 cm长的ODS柱分离两个组分，已知在实验条件下 柱效 n=2.84×104 m-1，用苯磺酸溶液测得死时间 t0=1.31 min，测得tR1=4.10 min及tR2=4.38 min。 求：（1）k1、k2 、α、R；
（2）若增加柱长至30cm，分离度可否达到1.5？
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六、高效液相色谱仪
Agilent 二元泵示意图
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
▪ 色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成
▪ 分析柱
φ 2-4.6mm L 10-25cm 常量柱
▪ 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
▪ 抑制剂: 弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
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HPLC
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法
4 固定相
5 流动相 6 高效液相色谱仪
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四、固定相
❖ 液-固色谱固定相 ❖ 载体：
▪ 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
R2 1.4
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分析化学教研室
谢谢！
YWG YQG
▪ 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
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四、固定相
❖ 化学键合相 特点： ▪ 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 ▪ 载样量大；适于梯度洗脱 分类：
非极性键合相：ODS
中等极性键合相：醚基键合相
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极性键合相：氨基、氯基键合相
四、固定相
❖ 非极性键合相：ODS ▪ 载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球 ▪ 表面覆盖度：
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三、各类高效液相色谱法
常用离子对试剂：
分析对象
离子对试剂
例如
碱
烷基磺酸钠
C5、C6、C7、C8 磺酸钠,SDS
酸
四丁基季铵盐
四丁基胺磷酸盐 （TBA）
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三、各类高效液相色谱法
4. 离子抑制色谱法(ISC) ▪ 分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解， 增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸， 弱碱的目的
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三、各类高效液相色谱法
3. 离子对色谱法(IPC,PIC) ▪ 分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成 不带电的中性离子对，以改善分离
▪ 机理：
流动相
B+H+
BH+ +
RSO3Na
RSO-3+Na+
固定相
[BH+.RSO-3] 中性离子对
[BH+.RSO-3] ↗
增加了在非极性固定相中溶解度。
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五、流动相
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HPLC
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法 4 固定相 5 流动相
6 高效液相色谱仪
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六、高效液相色谱仪
HPLC
进样器
Fra Baidu bibliotek
输液泵
高效液相色谱仪
工作站
检测器
色谱柱
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ▪ 泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵
▪ 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 ▪ 例如：TLC
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三、各类高效液相色谱法
❖ 液液分配色谱法 ▪ 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 ▪ 分类:概念及保留行为（重要）
正相色谱 NPLC
•固定液极性 > 流动相极性 •极性小的组分先出柱，极性大的组分 后出柱
反相色谱 RPLC
二、基本原理
范氏方程（van Deemter equation) H = A + Cu A = 2λdp C = Cm+ Csm
❖ 影响因素： • λ↓ 选球形固定相，高压、匀浆装柱法 • dp↓ 选粒径小的化学键合相 • C↓ 选粘度小、低流速的流动相
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高效液相色谱法
1
概述
2
基本原理
3 各类高效液相色谱法
•惰性气体
一、概 述
HPLC与GC区别
分析对象 流动相差别
HPLC
不受样品挥 发性和热稳定 性的限制，占 有机物的 80%
液体，种类 较多，选择余 地广
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一、概 述
HPLC仪器示意图
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一、概 述
Agilent 1100
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一、概 述
HPLC仪器图
SHIMADZU
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六、高效液相色谱仪
色谱－光谱图
波长(nm)
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T/min
六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
2414RID
2465ECD
2489UVD
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2424ELSD
六、高效液相色谱仪
❖ 超高效液相色谱仪(waters)
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小结
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三、各类高效液相色谱法
2. 正相键合相色谱法(NBPC) ▪ 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别 ▪ 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 ▪ 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
▪ 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
习题及解答
选择题：
1. 键合相的键合基团的碳链长度增长后 ( A)C
A.极性减少
B.极性增大
C.载样量增大 D.载样量减少
2. 提高色谱柱柱效的可行方法是 ( AB) CD
A.选择小粒度的固定相 B.降低固定相的粒度分布
C.选择球形固定相 D.匀浆装柱
E.增加柱长
F.选择适宜流动相
G.降低流速
开口毛细管柱 H = B/u + Cu
HPLC：
H = A + Cu
QB2Dm
Dm
T
原因：T↓；η↑； u↑→ 忽略B/u
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二、基本原理
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GC 和 HPLC 的 H-u 图
(1) B/u (2) Cu (3) A (4) HPLC 的uopt (5) GC 的uopt
❖ HPLC：
R n1 k2 4 1k2
▪ α 与固定相性质和流动相种类有关 ▪ k 与流动相配比有关
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五、流动相
❖ 正相洗脱 ❖ 反相洗脱
流动相的极性小于固定相的洗脱 流动相的极性大于固定相的洗脱
❖ 洗脱方式：
等度洗脱(isocratic elution) 恒定配比的溶剂系统洗脱
梯度洗脱(gradient elution) 在一个分析周期内不断改变流动相的比例
了解
•HPLC的特点. •HPLC的仪器 结构及各部件.
熟悉
•HPLC中色谱 条件的选择. •化学键合相 色谱法.
掌握
•范氏方程在 HPLC的表达 形式. •分离度影响 因素 •正相色谱和 反相色谱.
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习题及解答
填空题： 1. 反相色谱中固定相的极性 小于流动相的极性. 2. HPLC中范氏方程的表达式为: _H___=___A__+___C_u_______ 3. HPLC流动相的pH值应控制为__2_-_8_______
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习题及解答
解：（1）
k1ttR '01
tR1t04.1 01.31 2.13
t0
1.31
同理：
k2
4.381.312.34 1.31
k2 2.341.10
k1 2.13
R n1 k2 1.0 4 1k2
（2）
R
2 1
R
2 2
L1 L2
1 .0 2
R
2 2
0 .1 5 0 .3 0
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1. 反相键合相色谱法(RBPC) ▪ 分离机制：疏溶剂理论等 ▪ 固定相：非极性的键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱) ▪ 流动相：极性大的流动相 如:甲醇-水或乙腈-水
▪ 流动相极性与k的关系: 极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 极性大的组分先出柱
▪ 应用：非极性--中等极性组分(80%)
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
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高效液相色谱仪分析流程仿真系 统
分析化学教研室
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高效液相色谱法
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法 4 固定相 5 流动相 6 高效液相色谱仪
小结 习题及解答
一、概 述
❖ 高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的 理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。
•固定液极性 < 流动相极性 •极性大的组分先出柱，极性小的组分 后出柱
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三、各类高效液相色谱法
化学键合相色谱法
(bonded phase chromatography，BPC)
概念：固定液的官能团通过 化学反应键合在载体表面
反相键合相
正相键合相
离子对
离子抑制
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三、各类高效液相色谱法
参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。 其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。
▪ 键合基团键长：键长↑，载样量↑，k↑
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HPLC
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法 4 固定相
5 流动相
6 高效液相色谱仪
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五、流动相
❖ 要求： ▪ 与固定液不反应；对样品有良好溶解度 ▪ 粘度小；与检测器匹配
AGILENT
WATERS
一、概 述
application
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高效液相色谱法
1 概述
2 基本原理
3 各类高效液相色谱法 4 固定相 5 流动相 6 高效液相色谱仪
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二、基本原理
❖ 范氏方程（Van Deemter equation)：重要
GC：
填充柱 H = A + B/u + Cu
4
固定相
5
流动相
6
高效液相色谱仪
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三、各类高效液相色谱法
1
液固吸附色谱法（LSC）
2
液液分配色谱法（LLC）
3
化学键合相色谱法（BPC
）
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三、各类高效液相色谱法
❖ 液固吸附色谱法
▪ 分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活 性中心
▪ 固定相:硅胶 ▪ 流动相:底剂（烷烃）+ 极性调节剂
❖ 简称：HPLC；HRLC；SPLC； UPLC 超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography）
❖ 与经典LC相比——高效 ◇ 高效填料：3～5μm ◇ 高压泵输液 ◇ 高灵敏度的检测器:在线检测
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GC
•能气化、热 稳定性好、且 沸点较低的样 品，占有机物 的20%
φ 1-1.5mm L 10-20cm 常微量柱
▪ 制备柱
φ 20-50mm L 3-25cm
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ▪ 检测器: 1. 紫外检测器 2. 荧光检测器 3. 蒸发光散射检测器 4. 其它检测器
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
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习题及解答
计算题： 1. 用15 cm长的ODS柱分离两个组分，已知在实验条件下 柱效 n=2.84×104 m-1，用苯磺酸溶液测得死时间 t0=1.31 min，测得tR1=4.10 min及tR2=4.38 min。 求：（1）k1、k2 、α、R；
（2）若增加柱长至30cm，分离度可否达到1.5？
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六、高效液相色谱仪
Agilent 二元泵示意图
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
▪ 色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成
▪ 分析柱
φ 2-4.6mm L 10-25cm 常量柱
▪ 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
▪ 抑制剂: 弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
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HPLC
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法
4 固定相
5 流动相 6 高效液相色谱仪
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四、固定相
❖ 液-固色谱固定相 ❖ 载体：
▪ 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
R2 1.4
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分析化学教研室
谢谢！
YWG YQG
▪ 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
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四、固定相
❖ 化学键合相 特点： ▪ 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 ▪ 载样量大；适于梯度洗脱 分类：
非极性键合相：ODS
中等极性键合相：醚基键合相
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极性键合相：氨基、氯基键合相
四、固定相
❖ 非极性键合相：ODS ▪ 载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球 ▪ 表面覆盖度：
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三、各类高效液相色谱法
常用离子对试剂：
分析对象
离子对试剂
例如
碱
烷基磺酸钠
C5、C6、C7、C8 磺酸钠,SDS
酸
四丁基季铵盐
四丁基胺磷酸盐 （TBA）
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三、各类高效液相色谱法
4. 离子抑制色谱法(ISC) ▪ 分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解， 增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸， 弱碱的目的
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三、各类高效液相色谱法
3. 离子对色谱法(IPC,PIC) ▪ 分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成 不带电的中性离子对，以改善分离
▪ 机理：
流动相
B+H+
BH+ +
RSO3Na
RSO-3+Na+
固定相
[BH+.RSO-3] 中性离子对
[BH+.RSO-3] ↗
增加了在非极性固定相中溶解度。
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五、流动相
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HPLC
1 概述 2 基本原理 3 各类高效液相色谱法 4 固定相 5 流动相
6 高效液相色谱仪
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六、高效液相色谱仪
HPLC
进样器
Fra Baidu bibliotek
输液泵
高效液相色谱仪
工作站
检测器
色谱柱
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六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ▪ 泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵
▪ 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 ▪ 例如：TLC
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三、各类高效液相色谱法
❖ 液液分配色谱法 ▪ 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 ▪ 分类:概念及保留行为（重要）
正相色谱 NPLC
•固定液极性 > 流动相极性 •极性小的组分先出柱，极性大的组分 后出柱
反相色谱 RPLC
二、基本原理
范氏方程（van Deemter equation) H = A + Cu A = 2λdp C = Cm+ Csm
❖ 影响因素： • λ↓ 选球形固定相，高压、匀浆装柱法 • dp↓ 选粒径小的化学键合相 • C↓ 选粘度小、低流速的流动相
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高效液相色谱法
1
概述
2
基本原理
3 各类高效液相色谱法
•惰性气体
一、概 述
HPLC与GC区别
分析对象 流动相差别
HPLC
不受样品挥 发性和热稳定 性的限制，占 有机物的 80%
液体，种类 较多，选择余 地广
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一、概 述
HPLC仪器示意图
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一、概 述
Agilent 1100
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一、概 述
HPLC仪器图
SHIMADZU
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六、高效液相色谱仪
色谱－光谱图
波长(nm)
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T/min
六、高效液相色谱仪
❖ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
2414RID
2465ECD
2489UVD
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2424ELSD
六、高效液相色谱仪
❖ 超高效液相色谱仪(waters)
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小结
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三、各类高效液相色谱法
2. 正相键合相色谱法(NBPC) ▪ 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别 ▪ 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 ▪ 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
▪ 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱