农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究
孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星
【摘要】通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tume aciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持.利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件.研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3～0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液0D600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高.测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6～8周的烟草适合分析.通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件.【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2015(024)001
【总页数】5页(P161-165)
【关键词】烟草;基因瞬时表达;注射渗透法
【作者】孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星
【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植
物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100
【正文语种】中文
【中图分类】S432.2
在植物组织中可通过2种方法表达异源基因：稳定表达和瞬时表达[1]。

瞬时表达
较前者具有简单、快速、周期短、准确等优点，表达效率稳定，转化率高，并且不产生可遗传的子代，生物安全性高[2]。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的瞬时表达体系是分析基因功能的快速有效的方法，可应用于转基因互补[3-6] 、启动子功能分析[7-8] 和蛋白表达[9-10] 等方面。

影响农杆菌介导的基因瞬时表达效率的因素有农杆菌菌悬液OD600值及其遗传背景(菌系)、植物遗传背景(品种)及生长发育阶段等[2]。

Kim等[11] 分别利用5个菌系来比较瞬时表达效率，结果发现，LBA4404的表达效率最高，且不同菌系的最
高表达效率的OD600值不完全相同；当农杆菌菌悬液OD600值为1.2时，注射后出现卷叶和黄化症状，当OD600值为0.3或更低时，转化效率降低，当
OD600值为0.6～0.9时，其转化效率最高；将φ=0.01%的Triton X-100或
φ=0.01%的Tween-20用于浸润缓冲液，其表达水平大约增加1.6倍，同时在注
射后第3天报告基因的表达水平最高。

Wroblewski等[2] 利用15955、1D1249、A281和K12等野生菌系分别渗透本氏烟、莴苣和拟南芥，结果发现：1D1249和159555在莴苣和拟南芥上的GUS表达较弱，而在本氏烟上的表达较强，A281
在莴苣中表达也较弱，但在拟南芥和本氏烟中的表达较强，K12的GUS基因在莴苣和拟南芥中的表达介于中间水平，而在本氏烟中的表达水平较高。

植物通过2种防御机制响应病原菌的侵染，一种是识别并响应病原菌特征分子或
微生物特征分子，另一种是直接或间接地响应病原菌效应因子[12]。

前人在研究亚
麻对亚麻锈菌抗病性的基础上，提出基因对基因模型[13] ，即当有一对抗病基因
和无毒基因存在的情况下，就可以引发过敏性坏死反应(Hypersensitive Response，HR)，马铃薯晚疫病抗病基因RB和致病疫霉菌效应基因 Avrblb1互
作可引发HR[14]。

本研究利用RB和 Avrblb1为报告基因，GUS基因为空白对照，以本氏烟和6个普通烟草品种为材料，采用农杆菌介导的注射渗透法，分析烟草
的基因瞬时表达的最佳条件。

1.1 材料
1.1.1 供试菌系和载体采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌系AGL1、GV3101和C58C1；采用电击法转化农杆菌，常规方法制备感受态细胞；植物表
达载体pART27-GUS、pART27-Avrblb1、pCAMBIA1200-RB均由西北农林科
技大学卵菌遗传与生物学实验室构建保存；晚疫病抗性基因RB由美国威斯康辛大学Jiming Jiang教授惠赠。

1.1.2 烟草品种本氏烟(Nicotiana benthamiana)，普通烟(Nicotiana tobacum)
品种K346、K326、NC89、云烟87、秦烟95和红花大金元。

1.2 方法
1.2.1 农杆菌转化取25 μL农杆菌感受态细胞，置于冰上解冻，加入1 μL重组质
粒(约1 ng)，轻柔混匀，电击处理后重悬于1 mL LB培养液(胰蛋白胨 10 g/L，
酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，调节pH至7.0)，于28 ℃，200 r/min培养约1.5 h；吸取50 μL细胞涂于带有合适抗生素的LB平板，置于28 ℃生化培养箱中培养约2 d。

1.2.2 农杆菌注射渗透法[15] 采用转化pART27-GUS的农杆菌为对照，转化pART27-Avrblb1和pCAMBIA1200-RB的农杆菌为试验组。

收集农杆菌菌液于
2 mL 离心管，4 000 r/min 离心5 min，去上清，加0.8 mL(或1 mL)重悬液(MES 2.132 g/L，Mg Cl2·6H2O 2.03
3 g/L，pH 5.6，使用前加入200 μmol/L
乙酰丁香酮，50 mL LB液体培养基加100 μL乙酰丁香酮)，涡旋；测OD600值，用重悬液将菌液OD600值调至0.8，然后按不同比例组合至所需OD600值，放
置1～3 h；烟草叶片注射后喷适量水，套保鲜袋，置于22 ℃，18 h/6 h光照/黑暗交替的温室中培养；次日揭保鲜袋，连续3～7 d观察坏死斑并记录。

2.1 农杆菌不同OD600值对其介导的基因瞬时表达的影响
Wroblewski等[2] 在优化莴苣、番茄和拟南芥的瞬时表达分析试验中，发现菌悬
液OD600值低于0.1时基因表达量；OD600值高于1.0时，引起组织变黄或枯萎。

莴苣瞬时表达的最佳OD600值为0.3～0.8。

本研究设置OD600值分别为0.4、0.6和0.8， AGL1、GV3101和C58C1菌悬液按1∶1的体积比混合，在本氏烟草上共表达RB和 Avrblb1，3个农杆菌菌系介导的基因瞬时表达效率一致，烟草叶片均出现明显的坏死斑，对照GUS基因未出现坏死现象。

2.2 农杆菌不同菌系介导的基因瞬时表达
以OD600值0.8分析不同农杆菌菌系的表达效率差异。

通过3个农杆菌在本氏烟草上共表达RB和 Avrblb1，当菌悬液中RB与 Avrblb1体积比为1∶1时，即混
合菌液中RB和 Avrblb1的有效OD600值为0.4，AGL1、GV3101和C58C1介导的基因瞬时表达效率一致，烟草叶片均出现明显的坏死斑；当菌悬液中RB与Avrblb1体积比为3∶1时，即RB和 Avrblb1的有效OD600值分别为0.6和
0.2，本氏烟叶片出现同样明显的坏死斑。

当菌悬液中RB与 Avrblb1体积比为7∶1时，即RB和 Avrblb1的有效OD600
值分别为0.7和0.1，GV3101和C58C1介导的基因瞬时表达效率下降，本氏烟
叶片坏死症状减轻。

当OD600值为0.8的菌悬液中RB、 Avrblb1和农杆菌的体积比为1∶1∶7时，即RB和 Avrblb1的有效OD600值均低于0.1，仅AGL1介导的基因瞬时表达产生明显的坏死反应，而GV3101和C58C1介导的基因瞬时表达效率均较低。

对照GUS基因未出现坏死。

2.3 不同烟草品种的基因瞬时表达效率
以本氏烟、普通烟K346、K326、NC89、云烟87、秦烟95和红花大金元7种烟草品系为材料进行的基因瞬时表达测试。

在苗龄均为6～8周的烟草叶片上注射
GV3101(OD600值0.8)，按1∶1的体积比混合共表达RB和 Avrblb1的效率没
有差别，坏死反应剧烈程度相当。

所测试的烟草品种均具有较高的瞬时表达效率。

图1为本氏烟、秦95和红花大金元的瞬时表达结果。

图中GUS表示未出现坏死，坏死部分均为RB和 Avrblb1共表达的结果。

图2为本氏烟、秦95和红花大金元上注射不含菌液成分溶液的瞬时表达，即注射重悬液MES的结果。

2.4 烟草不同生长时期和生理状态对基因瞬时表达的影响
普通烟品种秦95在苗龄为6～8周和8～10周时，分别用GV3101、菌悬液
OD600值为0.8按体积比1∶1共表达RB和 Avrblb1，结果显示，6～8周较
8～10周的叶片瞬时表达效率较高，表现的坏死反应更剧烈，而8～10周叶片只
有轻微坏死，故苗龄为6～8周更适合基因瞬时表达测试。

除苗龄外，烟草叶片的生理状态也影响瞬时表达效率。

活体叶片较离体叶片瞬时表达效率高，菌悬液GV3101在活体叶片按体积比1∶1共表达RB和 Avrblb1，4
d后产生坏死斑，坏死反应剧烈，而离体叶片在混合注射后，烟草叶片上只出现轻微褪绿现象。

对照GUS基因未出现坏死。

农杆菌介导的瞬时表达是一种应用极广泛的基因瞬时表达方法，本氏烟草是瞬时表达体系的模式植物[16-17]。

由于不同农杆菌菌系染色体背景和Ti质粒不同，其对植物的亲和力及侵染力有一定差别，造成在同种植物上的瞬时表达效率不同。

目前，用于瞬时表达的农杆菌常用菌系有C5851、AGL1和GV3101等[2]。

同一个农杆菌菌系在不同植物中的表达效率也有差别[2]。

Zottini等[18] 采用GFP报告基因
将3个不同的农杆菌菌系LBA4404、GV3101和AGL1浸润不同的葡萄品种，结果都为阳性，并未比较出菌系间的差别。

本研究发现，RB和 Avrblb1菌悬液的有
效OD600值为0.1及以上时，AGL1、GV3101和C58C1均介导较高的瞬时表达效率，而OD600值低于0.1时仅AGL1有较高的基因瞬时表达效率。

不同品种的烟草瞬时表达效率也不尽相同。

对本氏烟草和6个普通烟草品种进行分析，发现所测试的烟草品种均具有较高的瞬时表达效率。

植物处于不同生理状态，瞬时表达外源基因的效率有所差异。

Sheludko等[19] 采用GFP报告基因比较不同苗龄的本氏烟草及不同部位叶片之间的瞬时表达效率差异，发现本氏烟基因瞬时表达的最佳生理时期为开花前1～6叶期，苗龄较大或较小的叶片表达效果均较差；Burch-Smish等[20] 在拟南芥2～3叶期注射农杆菌，其沉默效率最高，而在4～5叶期时，其沉默效率下降50%，从而得出幼嫩叶片是更好的试验材料。

本研究分析菌悬液OD600值、遗传背景、烟草品种及其生长时期，并对根癌农杆菌介导的烟草基因瞬时表达影响因素进行分析，确认OD600值分别为0.4、0.6和0.8时，AGL1、GV3101和C58C1农杆菌菌系在本氏烟上介导的瞬时表达RB 和 Avrblb1的效率较高且一致，表现在烟草叶片均出现明显的坏死斑，对照GUS 基因未出现坏死现象，注射不含菌液成分溶液即注射重悬液MES后，不表现任何反应。

当OD600值为0.8，RB和 Avrblb1菌悬液的有效OD600值为0.2～0.4时，AGL1、GV3101和C58C1均介导较高的基因瞬时表达效率；当RB和Avrblb1菌悬液的有效OD600值为0.1时，GV3101和C58C1介导的基因表达效率显著降低，表现为坏死减弱；当RB和 Avrblb1菌悬液的有效OD600值小于0.1时，仅AGL1介导的瞬时表达效率较高且稳定。

分析发现，本氏烟和普通烟K346、K326、NC89、云烟87、秦烟95和红花大金元7种烟草都具有较高的瞬时表达效率，苗龄为6～8周最适合瞬时表达测试，活体叶片较离体叶片瞬时表达效率高。

通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素，确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件。

这为目的基因的功能
研究提供技术支持，有望推动植物-病原菌互作研究中关键基因的鉴定与克隆[2]。

Reference (参考文献)：
[1] Marillonnet S,Thoeringer C,Kandzia R,et al.Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants [J].Nature Biotechnology,2005,23(6):718-723.
[2] Wroblewski T,Tomczak A,Michelmore R.Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in
lettuce,tomato and Arabidopsis[J].Plant Biotechnology
Journal,2005,3(2):259-273.
[3] Bendahmane A,Querci M,Konstantin K,et al.Agrobacterium transient expression system as a tool for the isolation of disease resistance genes:application to the Rx2 locus in potato [J].The Plant
Journal,2000,21(1):73-81.
[4] Johansen L K,Carrington J C.Silencing on the spot.induction and suppression of RNA silengcing in the Agrobacterium-mediated transient expression system [J].Plant Physiology,2001,126(3):930-938.
[5] Shao F,Golstein C,Ade J,et al.Cleavage of Arabidopsis PBS1 by Bacterial Type Ⅲ Effector [J].Science,2003,301(5637):1230-1233.
[6] Van der Hoorn R A L,Laurent F,Roth R,et al.Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced necrosis [J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2000,13(4):439-446.
[7] Grefen C,Donald N,Hashimoto K,et al.A ubiquitin-10 promoter-based vector set for fluorescent protein tagging facilitates temporal stability and native protein distribution in transient and stable expression studies [J].The
Plant Journal,2010,64(2):355-365.
[8] Yang Y,Li R,Qi M.In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves [J].The Plant
Journal,2000,22(6):543-551.
[9] Vaquero C,Sack M,Chandler J,et al.Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America,1999,96(20):11128-11133.
[10] Vaquero C,Sack M,Schuster F,et al.A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco [J].The FASEB Journal,2002,16(3):408-410. [11] Kim M J,Baek K,Park C M.Optimizaiton of conditions for transient Agrobacterium-mediated gene expression assays in Arabidopsis[J].Plant Cell Reports,2009,28(8):1159-1167.
[12] Jones J D G,Dangl J L.The plant immune system
[J].Nature,2006,444(7117):323-329.
[13] Flor H H.Current status of the gene-for-gene concept [J].Annual Review of Phytopathology,1971,9(1):275-296.
[14] Vleeshouwers V G A A,Raffaele S,Vossen J H,et al.Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors [J].Annual Review of Phytopathology,2011,49(1):507-531.
[15] Imogen A S,John R,Anne K,et al.Rapid,transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants [J].Nature Protocols,2006,1(4):2019-2025.
[16] Goodlin M M,Zaitlin D,Naidu R A,et al. Nicotiana benthamiana:its
history and future as a model for plant-pathogen interactions [J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2008,21(8):1015-1026.
[17] Nasir K H B,Takahashi Y,Ito A,et al.High-throughput in planta expression screening identifies a classⅡ ethylene-responsive element binding factor-like protein that regulates plant cell death and non-host resistance [J].The Plant Journal,2005,43(4):491-505.
[18] Zottini M,Barizza E,Costa A,et al.Agroinfiltration of grapevine leaves for fast transient assays of gene expression and for long-term production of stable transformed cells [J].Plant Cell Reports,2008,27(5):845-853. [19] Sheludko Y V,Sindarovska Y R,Gerasymenko I M,et parison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression [J].Biotechnology and Bioengineering,2007,96(3):608-614.
[20] Burch-Smith T M,Schiff M,Liu Y L,et al.Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis[J].Plant Physiology,2006,142(1):21-27.。