造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

建立 一 种 长 期 、 稳 定、 直观且不影响组织细胞 形成能力 的 标 记 方 法 是 进 行 干 细 胞 分 化 与 定 位 研 究的有效工 具 。 常 用 的 干 细 胞 标 记 方 法 有 LacZ 基 2 脱氧尿嘧啶核苷 因、 荧 光 染 料 Hochest 和 5-溴 （ BrdU ） 等， 这些免疫组化染色的缺陷是只能 在 组 织 迁 移 和 分 化 情 况， 需要 切片上观察 干 细 胞 的 存 活 、 牺牲大量 的 实 验 动 物 来 观 察 不 同 时 间 点 干 细 胞 在 体内的转归， 无 法 实 时、 纵向监测干细胞在体内的 动态迁移 过 程
（ 中国医学科学院， 北京协和医学院， 医学实验动物研究所， 卫生部人类疾病比较医学重点实验室， 国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室， 北京 100021 ）
【摘要 】 目的
对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析， 筛选造血干细胞全 标 记 红 色 采用活体荧光影像系
和绿色荧光转基因小鼠， 为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模 型 。 方 法
造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠 。 结果
活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或 筛选获得 在 造 血
ຫໍສະໝຸດ Baidu
C57BL /6J-TgN （ CAG-DsRed绿色荧 光 。 流 式 细 胞 术 检 测 表 明 LSK 造 血 干 细 胞 中 高 度 表 达 红 色 和 绿 色 荧 光 ， 其 中， 1 ） ZLFILAS 的造血干细胞全部为荧光标记细胞 。 结论 1 ） ZLFILAS 和 C57BL /6J-TgN （ CAG-EGFP干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠， 可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具 。 【关键词 】 红色荧光蛋白；绿色荧光蛋白；转基因；造血干细胞；小鼠 【中图分类号 】R349. 83 ； R332 【文献标识码 】A 【文章编号 】16717856 （ 2011 ） 05001404 doi ： 10． 3969 / j． issn． 1671． 7856． 2011． 05． 004
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制备转基因 植 到 ICR 假 孕 受 体 小 鼠 输 卵 管 中 ， 小鼠 1. 2
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活体荧光影 像 系 统 分 析 红 色 和 绿 色 荧 光 转 基 将各 品 系 荧 光 转 基 因 阳 性 小 鼠 用 三 溴 乙 醇
因小鼠 （ 0. 18 mL /10 g ） 麻 醉 后 放 入 活 体 荧 光 影 像 系 统 的 SlideBook 4. 0 软 件 进 行 分 析 （ 日 本 暗 箱 中 拍 照， Roger 公司） 。 1. 3 小鼠 LSK 造血干细胞的荧光标记分析 颈椎脱臼 牺 牲 小 鼠， 取 双 腿 胫 骨、 股骨用预冷 吹打成单细胞悬 的 PBS 冲 出 骨 髓 腔 的 骨 髓 细 胞，
1 和 CAG-DsRed2 ） ZLFILAS 和 三 种 绿 色 荧 光 转 基 统对两种红色荧光转基因小鼠品 系 C57BL /6J-TgN （ CAG-DsRed1、 CAG-EGFP2 和 CAG-EGFP3 ） ZLFILAS 的 荧 光 标 记 进 行 比 较；采 用 流 式 因小鼠品系 C57BL /6J-TgN （ CAG-EGFP（ －） c － kit （ + ） Sca1 + （ LSK ） 造 血 干 细 胞 荧 光 标 记 细 胞 比 率 ，根 据 标 记 比 率 筛 选 细胞术检测各转基因小鼠的骨髓 lin
Selection of Transgenic Mouse Models with Totally Labeled Fluorescence in Hematopoietic Stem Cell
ZHANG Xiao-juan ，LI Xiao-ying ，SHI Hai-xia ，GE Wen-ping ，LIANG Hong ，ZHANG Lian-feng （ Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine ，Ministry of Heath ； Institute of Medical Laboratory Animal Science ，Chinese Academy of Medical Sciences ； Key Laboratory of Human Diseases Animal Models ，State Administration of Traditional Chinese Medicine ； Beijing Union Medicine College ，Beijing 100021 ，China ） To compared the ratios of fluorescence labeling cells to the lin （ － ） c-kit （ + ） Sca1 + （ LSK ） The expressions of the fluorescent protein in
μ L 全骨髓细胞悬液至于 96 孔板一孔中， 加入 Biotin Gr1-Biotin 、 偶联的 7 种 lineage 抗 体 （ CD11b-Biotin 、 Ter119-Biotin 、 IL7R-Biotin 、 B220-Biotin 、 CD4-Biotin 、 CD8-Biotin ） （ Biolegend ） ， 冰上孵育 30 min ， 加入 200 400g 5 min 离 μ L staining medium （ PBS + 1% BSA ） ， 心 弃 上 清 后，加 入 Scal （ Iy6A / E ） -PE-cy7、ckit （ CD117 ） -APC、 Anti-Biotin-APC-cy7 抗 体 （ Biolegend ）， 冰上 避 光 孵 育 30 min ， 离 心， 弃 上 清， 用 500 uL staining medium 重 新 悬 浮 细 胞， 移至流式管中准备
［基金项目］国家科技重大专项 “艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治 ” （ 2009ZX10004 － 307 ） ；十一五新药专项支持（ 2009ZX09501026 ） 。 ［通讯作者］张连峰， E-mail ： lianfeng_zhang3 @ yahoo． com． cn 。 梁 E-mail ： lianghong5@ gmail． com 。 虹，
第 21 卷
2011 年 5 月 第5期
中国比较医学杂志 CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
May ，2011 Vol． 21 No． 5
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檵檵檵檵殝 研究报告 檵殝
造血干细胞全标记红色和绿色荧光 转基因小鼠的筛选
张晓娟 ， 李小颖 ， 施海霞 ， 葛文平 ， 梁 虹， 张连峰
【Abstract 】 Objective
stem cells from the five transgenic mouse lines ，selected the mouse lines of totally fluorescence labeled ，for tracking the hematopoietic stem cells and in vivo fluorescence imaging analysis． Methods investigated with flow cytometry． Results vivo were observed under in vivo fluorescence imaging system ， the expression of those genes in the stem cells were The fluorescent protein was expressed in most tissues in the five transgenic Two transgenic mouse lines were indicated in mice． The fluorescent protein expressions were observed in almost all LSK stem cells of C57BL /6J-TgN （ CAG-DsRed1） ZLFILAS and C57BL /6J-TgN （ CAG-EGFP1 ） ZLFILAS． Conclusions lines may be useful tools for in vivo tracking the hematopoietic stem cells． which LSK stem cells were marked completely by red or green fluorescence protein separately ，suggesting the two mouse
8 过 滤， 计 数， 调 整 浓 度 至 1 × 10 cell / mL 。 取 50 液，
。荧光发光是通过激发光激发荧
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光基团达到高能 量 状 态， 而 后 产 生 发 射 光。 常 用 的 有红色荧光 蛋 白 （ RFP ） 和 绿 色 荧 光 蛋 白 （ GFP ） 。 荧光成像 被 广 泛 用 于 细 胞 凋 亡 、 蛋 白 质 相 互 作 用、 免疫细胞迁移 、 癌 症 及 药 物 研 究 等 多 个 领 域。最 近 这项 技 术 开 始 被 用 于 干 细 胞 研 究， 可在活体 几年， 内观察干细胞的行 为 和 生 物 学 特 性 及 其 转 归， 准确 获得活体 动 物 体 内 靶 位 置 的 干 细 胞 在 各 时 间 点 的 生长和分化 情 况， 加 速 了 干 细 胞 在 肿 瘤、 组织工程 等领域的研究进展 。 为满足科学研 究 的 需 要， 国内外研究者建立了 多种荧光 转 基 因 小 鼠 。 但 由 于 转 基 因 载 体 构 建 所 靶基因染色体插入位置的位置 采用的启动子不同 、 效应以及转基因拷 贝 数 的 差 异， 不同荧光转基因小 从而 鼠的造血干细胞标 记 率 和 标 记 细 胞 亚 群 不 同， 影响了小 鼠 干 细 胞 荧 光 标 记 在 干 细 胞 研 究 中 的 进 一步应用 。 本 文 比 较 了 五 种 红 色 或 绿 色 荧 光 转 基 以期 因小鼠的造血干细 胞 中 荧 光 标 记 细 胞 的 比 率， 筛选造血干细胞全 标 记 荧 光 转 基 因 小 鼠， 为干细胞 示踪提供一种有效手段 。 1 1. 1 材料和方法 转基因小鼠的获得 两种红色 荧 光 转 基 因 小 鼠 品 系 分 别 被 命 名 为 C57BL /6J-TgN （ CAG-DsRed1 ） ZLFILAS 和 C57BL / 6J-TgN （ CAG-DsRed2 ） ZLFILAS 。 三 种 绿 色 荧 光 转 基因小鼠分别被命名为 C57BL /6J-TgN （ CAG-EGFP1 ） ZLFILAS 、 C57BL /6J-TgN （ CAG-EGFP2 ） ZLFILAS 3 ） ZLFILAS 。 转 基 因 和 C57BL /6J-TgN （ CAG-EGFP小 鼠 的 制 备 过 程 是 将 DsRed 基 因 和 EGFP 基 因 插 入 CAG 启 动 子 下 游 构 建 转 基 因 载 体 。 经 原 核 显 微 注 射 法 将 线 性 化 的 转 基 因 载 体 注 射 到 C57 BL /6 J 小鼠 的 受 精 卵 （ TE2000 -U 显 微 注 射 仪 ） ， 受精卵移
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中国比较医学杂志 2011 年 5 月第 21 卷第 5 期
Chin J Comp Med ，May 2011 ， Vol． 21． No． 5
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【Key words 】 cell ； Mouse
Red fluorescent protein ； Green fluorescent protein ； Transgene models ； Hematopoietic stem