薄膜过滤法

请参考
薄膜过滤微生物测试法
录入时间:2009-8-13 13:55:27 来源：食品伙伴网
--------------------------------------------------------------------------------
一、培养皿的准备
1．配备与待测样品数相同的无菌培养皿，另上一个作对照组（每种培养剂一个对照组），在每个培养皿上标上待测样品的记号
2．用烧过的镊子将无菌吸收垫从包装袋中取出，放入每个培养皿中，每取一个吸收垫，镊子需用火烧一次
3．打开培养皿盖子到刚能加上约1.8ml的培养剂在吸收垫上，强烈建议使用装有培养剂的小安瓿瓶、小瓶或小管，当处理大量样品时，可使用无菌的吸管来分配培养剂
二、培养剂的种类：
总菌数橙血清培养剂
酵母和霉菌数橙血清培养剂
大肠杆菌数 MF-Endo培养剂
粪便大肠杆菌数 M-FC培养剂
4应有足够的培养剂加入每个培养皿，使过滤膜能适当地粘附着吸收垫。

但过多的培养剂会引起菌落扩展重叠，常常得不到正确的计数结果。

有需要时，建议调整推荐的培养剂数，以便粘附和菌落生长。

三.过滤器支架的准备：
1. 打开预先灭菌的过滤器支架或将过滤器座、漏斗和漏斗盖在沸水中浸没一分钟作消毒。

若没有沸水，用95%酒精喷洒于漏斗和漏斗盖，然后将其点燃，在火熄灭以后，让过滤器冷却至40℃以下，如果必须使用酒精，漏斗必须用耐火材料制造。

2. 用水煮过或火焰灭菌钳子，将无菌过滤器的底座部分安装于过滤烧瓶或真空管道上。

3. 用火烧过的镊子放一张无菌薄膜在过滤器底座上，根据测试目的，使用特定的过滤膜：总菌数/大肠杆菌数：0.45um薄膜
酵母菌和霉菌：0.80um薄膜
4. 用水煮过或火焰灭菌钳子，将过滤器漏斗和漏斗盖放置于底座上。

如漏斗盖带有管口，则在管口处装上过滤器，或予以封住。

待过滤器的温度低于40℃后才可加样品。

5. 重复以上步骤，直到所有样品都完成过滤。

四.样品的过滤和平板培养
1. 无菌地将样品直接倒入消毒和冷却的过滤器漏斗中。

盖上过滤器漏斗的盖子。

若使用勺，须将勺放在95%的酒精的烧杯中。

2. 施加真空，使样品通过薄膜。

无菌地打开装有无菌水的玻璃瓶，先用火烧螺纹处，然后倒入约20毫升无菌水于过滤漏斗内，进行冲洗。

施加真空，使无菌水通过薄膜。

在过滤完样品或无菌水后，不要让真空施加时间连续超过30秒以上。

3. 用火焰灭菌钳子从过滤器底座上取下薄膜。

轻微提起装有吸收垫和培养剂的培养皿的盖子，并放下薄膜，直到镊子相对侧的薄膜边靠到吸收垫边为止。

将薄膜贴在吸收垫上滚动，以排除气泡。

盖上盖子，在工作台上轻轻拍打培养皿，以驱除薄膜下面的气泡。

4. 作为对照组，用无菌水代替样品重复上述过滤和平板培养程序。

每一种培养剂须制备一个空白培养皿。

五.样品培养
1.为了防止在过滤膜表面形成冷凝水，所有培养皿必须倒置于培养箱中。

2.在培养箱中放置一烧杯水，以维持适当的湿度。

3.在以下温度下培养可以得到最好的结果：
总菌数35℃
酵母菌和霉菌数28℃
大肠杆菌数35℃
注：只能使用一次性的培养皿，不能使用重复用的培养皿。

六.菌落数的计算
1. 总菌数
必须分别在培养24小时和72小时后计算菌数。

点计所有菌落（不管类型），并记录最高数目。

2. 酵母菌和霉菌数
在培养48小时后，计点酵母菌和霉菌数，并在此后每隔24小时再计点一次，直到过第五天，记录最高数目。

酵母菌通常为圆形的白色菌落。

有时他们也带有颜色。

在一天至两天后，一些酵母菌菌落的中心因吸收培养剂而变成蓝色。

霉菌菌落会显示不同颜色（包括白色、黄色、红色、蓝色和黑色），但从“绒毛状”或“棉花状”外观很容易辨认这种菌落。

通常霉菌菌落比细菌或酵母菌的菌落为大。

细菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示剂，而其颜色会变成蓝色、绿色、蓝绿色或褐色。

再这种培养剂中，细菌菌落比一般酵母菌小。

3.大肠杆菌数
大肠杆菌菌落呈绿色或墨绿色，并有明显的金属光泽。

在培养24小时后，只计算有“金属光泽”的菌落。