141、临床少见菌的分离与鉴定
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某些细菌生长需要的高营养和特殊生长因子 • 因此？？
革兰阳性球菌，怎么办？ • 维生素B6、半胱氨酸及营养成分 • 卫星试验
3
2015-06-03
以上方法还不能培养出细菌
•革兰阳性球菌、阴性杆菌
•未使用过血培养瓶肉汤XXml,琼脂粉， 加入1ml羊血或人血 ？？
•制成平板 P173??
《血流感染实验诊断与临床诊治第三版2014.5》
血培养阳性检出率偏低
采血量不足影响细菌生长
采血时机和套数的影响 仪器出现假阴性 药物对细菌培养的影响
主要原因
？？？ ？？？
？？？ ？？？
从开放性标本（痰、尿、伤口等）中发现难以鉴定的细菌，不能随意 丢弃或模棱两可的报告。(重复检验、纯)
从血培养、无菌液体、胸腹水等中发现
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2015-06-03
（一）血培养仪阳性报警 1.涂片查见细菌，平板不长。 2.革兰染色涂片未查见细菌，转种平板，24h不生长, ？？ 3.涂片查见细菌，平板生长，常规法不能鉴定。 （二）仪器不报警 临床怀疑感染,仪器不报警,认为阴性？？？。
主要原因
阳性培养瓶直接涂片
1
从阳性培养瓶中转种平板的菌落涂片
乏氧菌属 颗粒链菌属 心杆菌属 放线杆菌属 弗朗菌属 二氧化碳嗜纤维菌 嗜血杆菌属 布鲁菌属?? ……
主要内容
一． 如何发现少见菌株
2015-06-03
血培养瓶阳性报警涂片找到细菌， 在血琼脂平板和巧克力平板上， 5%CO2 、18～24h不生长 、72h仍不生长？
涂片结果？
转种血平板，巧克力，5%二氧化碳、24h、48h、72h 未生长。
问：此标本是否为假阳性？？
瑞氏染色： 瑞氏染色
10
• 再转种血平板、巧克力平板，未生长 • 标本送上海长征医院 • 下一步应如何处理？
2015-06-03
BD血瓶直接革兰染色
涂片革兰染色，镜下可见革兰 阳性球菌
第一种菌
接种在血琼脂平板和巧克力平板上
5%CO2，18～24h不生长 48h仍不生长 怎么办？
从培养瓶取培养物2～3滴在血琼脂平板上四区划线， 然后用金葡菌点种，5%CO2，35℃孵育18～24h
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2015-06-03
MALDI-TOF ？？？ 上机鉴定？？？
2015-06-03
• 接种血平板，麦康凯
• 麦康凯不长 • 血平板
• 用GN板条上机鉴定为甲基杆菌（t=0.996） • 这个鉴定结果可信度如何？？？
涂片形态发现与甲基杆菌不符，加做？？？
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• 用NH板条: • MALDI-TOF鉴定:
2015-06-03
• 小结： • ？？？菌误报为甲基杆菌，为什么？ • 由于检验人员缺乏经验，在镜下查见革兰阴性小球杆菌，没有怀
金葡菌周围细菌传代后，24h不需金葡点种，生长良好
鉴别要点： 1.与流感嗜血杆菌的鉴别 两者都有卫星现象 2.与其他链球菌的鉴别
？？？菌在未添加吡哆醛的普通血琼脂平板上仍然生长或不出现
卫星现象，很容易被鉴定为其他链球菌,应引起注意
小结 • 三种特性： （1）卫星现象和吡哆醛依赖试验 （2）金葡菌周围的菌落24h传代后，不需要金葡点种也生长良好 （3）？？？菌在未添加吡哆醛的普通血琼脂平板上仍然生长或不出现卫星现象 • 血培养阳性标本涂片查见革兰阳性球菌，转种任何平板不生长，可首先考虑
血培养瓶阳性报警，革兰涂片找不到细菌，有没有?
阳性报警，涂片革兰染色？？未查见细菌，转种 平板（24、48、72h不生长），是否假阳性？
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2015-06-03
• 因为细菌与细胞残渣？？？ • 革兰染色未查见细菌，用瑞氏染色 • 《血流感染实验诊断与临床诊治第三版2014.5》P117
二、几种少见菌的鉴定
血培养瓶涂片查见细菌，平板不生长。 为什么？？ 怎么办？？
（一）延长培养时间。 • 一般培养24h～48h，延长培养时间至2～4 周。
如一些革兰阴性杆菌生长缓慢(如伴放线杆菌 、 军团菌属、二• 置放二氧化碳孵育箱。
（二）营养要求高，需要特殊生长因子 • 血培养瓶内？？多种成分 • 血平板只有？？种成分
48小时菌 落
• 革兰阴性、细长的杆菌？？？
7
生化特性 氧化酶试验阴性，分解葡萄糖和蔗糖，分解乳糖不定，不分解木糖和蜜 二糖；水解淀粉，ONPG、七叶苷阳性。 硝酸盐、触酶、吲哚、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验均为阴性 。
• 怀疑是何种细菌？
2015-06-03
• 上机鉴定：？？？ MALDI-TOF：？？？ 测序： ？？？
疑？？？ • 规范：？？？ • 板条？NH ，GN ×
鉴定为甲基杆菌后，没有及时与临床沟通（甲基杆菌引起血流感染十 分罕见）。 • 少见菌检出后，一定要重复检验，不能完全相信机器。
患者，男，65岁 以“升结肠癌T4NxM1(肝） IV期 KPS 50，并脑梗塞后”入住大场医 院。 患者于2014年11月17日出现高热， 体温40.6℃，当即抽血培养 双侧，均为需氧瓶。置35°C温箱， 培养24小时观察，双瓶明显浑浊， 略产气，遂涂片镜检
？？？菌属和乏养菌
第二种菌
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2015-06-03
• 血平板上的菌落特征： 5％ CO2环境35℃培养18～24h，菌落呈细小，甚至看不见
• 2～4日后逐渐长大，可嵌入琼脂，有较弱的溶血环。 • 有的菌落黏附于琼脂培养基(咬琼脂现象)。 • 血琼脂平板上的菌落通常为灰白色、粉红色或黄色。 • 麦康凯琼脂上不生长。
2015-06-03
临床少见菌株的来源： 从开放性标本（痰、尿、伤口等）中发现难以鉴定的细菌，不能随意
丢弃或模棱两可的报告。(重复检验、纯)
从血培养、无菌液体、胸腹水等
Q问题：
血培养阳性检出率是多少？ 阳性检出率偏低主要有哪些原因？
血培养阳性检出率偏低
采血量不足影响细菌生长 采血时机和套数的影响 仪器出现假阴性 药物对细菌培养的影响
小结
• G-b细长，与梭杆菌十分相似 • 阳性瓶涂片革兰染色不太容易找到细菌（瑞氏染色的重要性） • 在血平板上18~24小时培养见不到菌落，48h？ • G-b，苛养菌？？，血平板生长，麦康凯上不生长 • 氧化酶试验阴性，分解葡萄糖，乳糖不定
第三种菌
外院的标本
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• 上机鉴定为甲基杆菌（t=0.996）
革兰阳性球菌，怎么办？ • 维生素B6、半胱氨酸及营养成分 • 卫星试验
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2015-06-03
以上方法还不能培养出细菌
•革兰阳性球菌、阴性杆菌
•未使用过血培养瓶肉汤XXml,琼脂粉， 加入1ml羊血或人血 ？？
•制成平板 P173??
《血流感染实验诊断与临床诊治第三版2014.5》
血培养阳性检出率偏低
采血量不足影响细菌生长
采血时机和套数的影响 仪器出现假阴性 药物对细菌培养的影响
主要原因
？？？ ？？？
？？？ ？？？
从开放性标本（痰、尿、伤口等）中发现难以鉴定的细菌，不能随意 丢弃或模棱两可的报告。(重复检验、纯)
从血培养、无菌液体、胸腹水等中发现
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2015-06-03
（一）血培养仪阳性报警 1.涂片查见细菌，平板不长。 2.革兰染色涂片未查见细菌，转种平板，24h不生长, ？？ 3.涂片查见细菌，平板生长，常规法不能鉴定。 （二）仪器不报警 临床怀疑感染,仪器不报警,认为阴性？？？。
主要原因
阳性培养瓶直接涂片
1
从阳性培养瓶中转种平板的菌落涂片
乏氧菌属 颗粒链菌属 心杆菌属 放线杆菌属 弗朗菌属 二氧化碳嗜纤维菌 嗜血杆菌属 布鲁菌属?? ……
主要内容
一． 如何发现少见菌株
2015-06-03
血培养瓶阳性报警涂片找到细菌， 在血琼脂平板和巧克力平板上， 5%CO2 、18～24h不生长 、72h仍不生长？
涂片结果？
转种血平板，巧克力，5%二氧化碳、24h、48h、72h 未生长。
问：此标本是否为假阳性？？
瑞氏染色： 瑞氏染色
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• 再转种血平板、巧克力平板，未生长 • 标本送上海长征医院 • 下一步应如何处理？
2015-06-03
BD血瓶直接革兰染色
涂片革兰染色，镜下可见革兰 阳性球菌
第一种菌
接种在血琼脂平板和巧克力平板上
5%CO2，18～24h不生长 48h仍不生长 怎么办？
从培养瓶取培养物2～3滴在血琼脂平板上四区划线， 然后用金葡菌点种，5%CO2，35℃孵育18～24h
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2015-06-03
MALDI-TOF ？？？ 上机鉴定？？？
2015-06-03
• 接种血平板，麦康凯
• 麦康凯不长 • 血平板
• 用GN板条上机鉴定为甲基杆菌（t=0.996） • 这个鉴定结果可信度如何？？？
涂片形态发现与甲基杆菌不符，加做？？？
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• 用NH板条: • MALDI-TOF鉴定:
2015-06-03
• 小结： • ？？？菌误报为甲基杆菌，为什么？ • 由于检验人员缺乏经验，在镜下查见革兰阴性小球杆菌，没有怀
金葡菌周围细菌传代后，24h不需金葡点种，生长良好
鉴别要点： 1.与流感嗜血杆菌的鉴别 两者都有卫星现象 2.与其他链球菌的鉴别
？？？菌在未添加吡哆醛的普通血琼脂平板上仍然生长或不出现
卫星现象，很容易被鉴定为其他链球菌,应引起注意
小结 • 三种特性： （1）卫星现象和吡哆醛依赖试验 （2）金葡菌周围的菌落24h传代后，不需要金葡点种也生长良好 （3）？？？菌在未添加吡哆醛的普通血琼脂平板上仍然生长或不出现卫星现象 • 血培养阳性标本涂片查见革兰阳性球菌，转种任何平板不生长，可首先考虑
血培养瓶阳性报警，革兰涂片找不到细菌，有没有?
阳性报警，涂片革兰染色？？未查见细菌，转种 平板（24、48、72h不生长），是否假阳性？
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2015-06-03
• 因为细菌与细胞残渣？？？ • 革兰染色未查见细菌，用瑞氏染色 • 《血流感染实验诊断与临床诊治第三版2014.5》P117
二、几种少见菌的鉴定
血培养瓶涂片查见细菌，平板不生长。 为什么？？ 怎么办？？
（一）延长培养时间。 • 一般培养24h～48h，延长培养时间至2～4 周。
如一些革兰阴性杆菌生长缓慢(如伴放线杆菌 、 军团菌属、二• 置放二氧化碳孵育箱。
（二）营养要求高，需要特殊生长因子 • 血培养瓶内？？多种成分 • 血平板只有？？种成分
48小时菌 落
• 革兰阴性、细长的杆菌？？？
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生化特性 氧化酶试验阴性，分解葡萄糖和蔗糖，分解乳糖不定，不分解木糖和蜜 二糖；水解淀粉，ONPG、七叶苷阳性。 硝酸盐、触酶、吲哚、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验均为阴性 。
• 怀疑是何种细菌？
2015-06-03
• 上机鉴定：？？？ MALDI-TOF：？？？ 测序： ？？？
疑？？？ • 规范：？？？ • 板条？NH ，GN ×
鉴定为甲基杆菌后，没有及时与临床沟通（甲基杆菌引起血流感染十 分罕见）。 • 少见菌检出后，一定要重复检验，不能完全相信机器。
患者，男，65岁 以“升结肠癌T4NxM1(肝） IV期 KPS 50，并脑梗塞后”入住大场医 院。 患者于2014年11月17日出现高热， 体温40.6℃，当即抽血培养 双侧，均为需氧瓶。置35°C温箱， 培养24小时观察，双瓶明显浑浊， 略产气，遂涂片镜检
？？？菌属和乏养菌
第二种菌
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2015-06-03
• 血平板上的菌落特征： 5％ CO2环境35℃培养18～24h，菌落呈细小，甚至看不见
• 2～4日后逐渐长大，可嵌入琼脂，有较弱的溶血环。 • 有的菌落黏附于琼脂培养基(咬琼脂现象)。 • 血琼脂平板上的菌落通常为灰白色、粉红色或黄色。 • 麦康凯琼脂上不生长。
2015-06-03
临床少见菌株的来源： 从开放性标本（痰、尿、伤口等）中发现难以鉴定的细菌，不能随意
丢弃或模棱两可的报告。(重复检验、纯)
从血培养、无菌液体、胸腹水等
Q问题：
血培养阳性检出率是多少？ 阳性检出率偏低主要有哪些原因？
血培养阳性检出率偏低
采血量不足影响细菌生长 采血时机和套数的影响 仪器出现假阴性 药物对细菌培养的影响
小结
• G-b细长，与梭杆菌十分相似 • 阳性瓶涂片革兰染色不太容易找到细菌（瑞氏染色的重要性） • 在血平板上18~24小时培养见不到菌落，48h？ • G-b，苛养菌？？，血平板生长，麦康凯上不生长 • 氧化酶试验阴性，分解葡萄糖，乳糖不定
第三种菌
外院的标本
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• 上机鉴定为甲基杆菌（t=0.996）