鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用_王辉田

文章编号：1003－6946（2015）02－115－05

鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用

王辉田，李涛，黎伟豪，欧建平

（中山大学附属第三医院生殖医学中心，广东广州510630）

【摘要】目的：检测新建体外受精实验室培养体系的可靠与否，是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法：对昆明白小鼠进行超促排卵，手术获取昆明白小鼠雌雄配子进行体外受精和体内受精的胚胎；并进行体外培养观察两组鼠胚的受精率、2-细胞率、囊胚率及采用密度梯度离心法和上游法两种精液处理方法对小鼠体外受精胚胎发育情况的影响。结果：进行了30个周期的体内受精体外培养实验，共获卵1136枚；进行了35个周期的体外受精实验，共获卵1486枚。体内受精组获得的受精率（93.13ʃ1.46）%和2-细胞率（94.52ʃ1.67）%高于体外受精组的受精率（84.39ʃ2.87）%和2-细胞率（87.80ʃ3.21）%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。密度梯度离心法处理精液后，其受精率（90.32ʃ3.14）%和2-细胞率（88.54ʃ2.28）%高于上游法的受精率（76.46ʃ2.35）%和2-细胞率（82.67ʃ2.62）%，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：小鼠卵母细胞体内受精和体外受精后均有高的成胚率，体内受精后进行体外培养优于体外受精后培养，采用密度梯度离心处理精液实施体外受精优于上游法，鼠胚实验可对新建胚胎培养室的培养体系进行评估。

【关键词】鼠胚实验；体外受精；质量控制；胚胎培养

中图分类号：Ｒ332文献标志码：A

通讯作者：欧建平，Email：oujianping@hotmail．com

于被患者接受。操作简便、设备要求相对较低，具备超声介入条件的基层医院均可以推广。

研究认为，聚桂醇注射液主要是使绒毛附着处肌层血管闭塞，故主要适用于病灶累及肌层，子宫肌层连续性尚存在的CSP患者［9］。CSP处肌层菲薄，行B 超监护下胚囊清除术联合清宫术，可将不可视的清宫术变为相对可视的，减少子宫穿孔及残留。

本技术开展时间尚短，查阅文献联盟（万方数据库），国内外尚未见聚桂醇硬化剂广泛用于CSP治疗的报道。尚有诸多问题值得进一步探讨：瘢痕部位血供恢复情况，聚桂醇使用的最高剂量、最佳浓度，胚囊清除术联合清宫术的最佳时机，再次妊娠时子宫下段的伸展情况等尚需进一步随访观察。但超声介入下注入聚桂醇硬化剂治疗CSP成功率高，未出现明显副反应以及并发症，符合CSP治疗的原则，即最大限度地保留了女性的生育功能，不失为临床治疗CSP的又一适合部分女性患者和疗效满意的治疗方案，可供借鉴。

参考文献

［1］张淑珍，童水娟，寿坚．超声介入下注射硬化剂治疗剖宫产子

宫切口妊娠10例初探［J］．现代实用医学，2014，26（3）：274－

275．

［2］徐栋，李明奎，徐佳英，等．超声造影指导下聚桂醇硬化治疗子宫切口妊娠的临床价值［J］．中国超声影像学杂志，2014，23（2）：

162－164．

［3］蔡薇，杨太珠，罗红，等．剖宫产后瘢痕处妊娠经阴道超声图像分析的临床意义［J］．实用妇产科杂志，2009，25（10）：622－

624．

［4］郑艳，徐春丽．聚桂醇400临床应用进展［J］．药学进展，2012，31（2）：190－192．

［5］邓新粮，何小丽，肖松舒．剖宫产术后子宫切口部位妊娠保守治疗16例疗效分析［J］．实用妇产科杂志，2008，24（6）：372－373．［6］陈春林主编．妇产科放射介入治疗学［M］．北京：人民卫生出版社，2003：393－395．

［7］邵华江，马建婷，徐丽萍．剖宫产瘢痕妊娠治疗方法与疗效综合分析［J］．中华医学杂志，2012，92（31）：2191－2194．

［8］汪芳，石珍，朱亚飞，等．高强度聚焦超声治疗子宫切口妊娠临床分析［J］．中国超声医学杂志，2013，29（2）：177－179．

［9］倪雪君，谢阳桂，吴超，等．超声引导下瘤内注射聚桂醇硬化治疗子宫肌瘤的临床研究［J］．南通大学学报（医学版），2012，32

（5）：414－415，封2．

（收稿日期：2014-10-12；修回日期：2014-12-15）

TheＲole of Mouse Embryo Assay in the Quality Control of a Newly Constructed La-boratory for IVF Embryo Culture

WANG Huitian，LI Tao，LI Weihao，et al

（CenterforＲeproductive Medicine，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen university，Guangzhou Guangdong 510630，China）

Corresponding author：OU Jianping

【Abstract】Objective：To test the reliability of the embryo culture system of a newly constructed laboratory for IVF embryo culture and to testify whether it conforms to the requirement of in vitro cultivation of human embryo or not．Methods：Superovulation treatments with PMSG and HCG on Kunming mouse were conducted．Then male and female gametes as well as pronuclear embryo were obtained from surgical approaches for in vivo and in vitro fertilization，respectively．The two groups of mouse embryos were cultured in vitro to observe the fertilization rate，2-cell rate and blastocyst rate．The effect of density gradient centrifugation and upstream two methods of semen treated on mouse embryonic development of in vitro fertilization．Ｒesults：Totally1136oocytes in30-cycles of in vi-vo fertilization and totally1486oocytes in35-cycles of in vitro fertilization were obtained．In vivo the fertilization rate was（93.13ʃ1.46）%and2-cell rate was（94.52ʃ1.67）%were higher than that in vitro the fertilization rate was（84.39ʃ2.87）%and2-cell rate（87.80ʃ3.21）%，the differences between the two groups were statistically significant（P＜0.05）．There were statistically significant difference in fertilization rate（90.32ʃ3.14vs76.46ʃ2.35）%and2-cell rate（88.54ʃ2.28vs82.67ʃ2.62）%between destiny gradient centrifugation group and up-stream method group（P＜0.05）．Conclusions：The embryo development of in vivo and vitro fertilization mouse oo-cytes and two methods of semen processing have reached the requirements of indoor quality control，the results are better in vitro culture of vivo fertilization and density gradient centrifugation processing semen．So mouse em-bryo assay could used to evaluate the embryo culture system in the newly constructed assisted reproductive labo-ratory．

【Key words】Mouse embryo assay；In vitro fertilization；Quality control；Embryo culture

我国人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，AＲT）已呈现规范化发展，目前有超过300家治疗机构，每年开展AＲT治疗逾20万周期［1］。生殖医学中心胚胎培养室是人类胚胎的加工厂，是AＲT 顺利开展极为重要的核心部分。对于新建的胚胎培养实验室，其培养室的环境温度和湿度、仪器设备的温度和性能、试剂耗材的质量等是否达到配子及胚胎体外操作和生长发育的要求至关重要，因此在进行人类胚胎的体外操作和培养之前，要检测胚胎培养室的整个培养体系能否满足人胚胎的体外培养要求［2］。自从1984年Ackerman等［3］首先尝试用2-细胞鼠胚来作为胚胎实验室的质控方法，小鼠胚胎生物检测已成为评估新建体外受精（in vitro fertiliza-tion）实验室最为常用的方法。我院生殖医学中心于2013年12月建成体外受精胚胎培养室，前期对培养室进行“热处理”以去除在装修过程及仪器设备产生的挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC）后，于2014年3 4月在人体外受精条件下对昆明白小鼠进行体外受精鼠胚和体内受精胚胎进行体外培养研究，旨在对新建胚胎培养室的环境和培养体系进行检测，对技术员操作水平进行评估，为顺利开展人类胚胎体外培养提供可靠的实验依据和质量控制保证。1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物昆明白小鼠购自中山大学实验动物中心。雌鼠：65只，8 10周龄、体重40 45g；雄鼠：14只，10 12周龄、体重50 55g。

1.1.2主要药品与试剂孕马血清促性腺激素（PMSG）和绒促性素（HCG）购自杭州第二激素制药厂。精子梯度分离液（SpermGrad）、洗精液（Sper-mＲinse）为瑞典Vitrolife培养液系列。HE-PES缓冲的人输卵管液（HTF）操作液（1023）、第三代HTF培养液（1020）、卵裂培养液（1026）、囊胚培养液（1029）、血清蛋白替代品（SPS3010）、胚胎培养矿物油（4008P）等均为美国SA-GE公司生产的Quinn's系列产品。

1.2实验方法

1.2.1小鼠促排卵和鼠卵获取体内受精组：分6批次，每次选取5只健康的雌性小鼠在下午的18时对其腹部消毒后腹腔内注射PMSG10U（0.1ml），48小时后腹腔内注射HCG10U（0.1ml），然后与雄性小鼠1ʒ1合笼，20小时后颈椎脱臼法处死雌鼠，无菌条件下剪开下腹部后找到并取出输卵管，用1023洗涤去除血迹，然后将输卵管放入盛有1023+10%SPS的35mm的培养皿中，用1ml一次性注射器刺破输卵