传染病暴发疫情应急检测

PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具
有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的 体内复制。 PCR的改进与完善 DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段
PCR仪
T4 DNA聚合酶
耐热DNA聚合酶(一株水生
嗜热杆菌中提取)
用途广泛：
生命学科
医学工程
快速检出细菌的毒素
微生物快速检测仪器
三、现场快速微生物检查方法
炭疽杆菌抗原检、抗体测试剂（胶体金法）
土拉热菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）
鼠疫菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法） 布鲁氏菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法） A型肉毒毒素检测试剂（胶体金法） B型葡萄球菌肠毒素检测试剂（胶体金法） 沙眼衣原体、肺炎支原体、出血热等快速检测试剂 优点：检测速度快 缺点：假阳性率高
咽拭子、痰液、尿液、血液、脑脊液等；
用于病原抗体检测的标本，通常包括急性期和恢
复期血清、脑脊液。
尸体标本：采集有病理变化的脏器或组织。
注意无菌操作，尽量避免污染。
（一）标本采集
1.粪便标本
采集病人发病7日内的粪便标本用于病原检
测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放
入无菌采便管内并密封，4℃暂存立即(12h内)
一、实验室检测在传染病疫情中的作用
传染病疫情的核实、处置、总结评价 等方面离不开实验室检测结果的支持。如
传染病的诊断应包括流行病资料、临床病
史、体格检查和实验室检验结果等，再者
病原体的检出是确诊传染病的主要依据。
二、标本采集与运输
临床标本的采集可以分为：
用于病原分离或检测抗原用的标本，包括粪便、
提取病毒RNA模板：
a. b. c. d.
吸取560 µl 含有Carrier RNA的RL到1.5ml Ep离心管中。 加140 µl 1标本到上述离心管中，回旋振荡15秒。室温（15～25℃）孵育10 min。短暂离心一次。 加560 µl乙醇（96～100％）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡15秒。短暂离心一次。 从离心管中吸取630 µl溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，6000g（8000rpm）离心1 min。弃掉滤液，将 套管套回原吸附柱中。
e. f. g. h. i.
加500 µl 缓冲液GD，6000g（8000rpm）离心1 min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。 加500 µl漂洗液RW，6000g（8000rpm）离心1 min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。 13400g（12000rpm）离心3 min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。 打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。 将吸附柱放入一个新的1.5ml 无RNA酶离心管中，加入60µl Rnase－free ddH2O，盖上盖子，在室温 孵育5min，6000g（8000rpm）离心1 min。
送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长 期保存的标本存于－70℃冰箱。
2.肛拭子
采集病人发病7日内的肛拭子标本用于病 原检测。用采样棉签沾取少量生理盐水，适度 用力插入患者肛门，同一方向旋转采样棉签， 取出棉签放入装有3～5ml保存液（维持液、或 生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在 靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
疹液，迅速将棉签放入内装3 ～ 5ml病毒保存 液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的 采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管 盖并密封。可同时采集同一病例的多个疱疹作 为一份标本。
5.血液样本的采集：作血液病原培养、核酸检测时, 严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无菌的有螺口 的抗凝的容器或培养瓶中送检。 6.血清标本：采集急性期(发病0～5d)和恢复期(发 病14～ 30d)双份配对血清用于抗体检测。检测 IgM时,采集(发病7～20d)血。静脉采集3～5ml全 血,置于真空无菌采血管中,自凝后,离心分离血清 于无菌带垫圈的血清管中,旋紧管盖并密封。
j.
提取的病毒RNA模板可立即进行逆转录，或贮存于－70℃备用。
全自动核酸提取简介
RT－PCR反应条件:

50℃ 40分钟； 94℃ 5分钟； 94℃ 30秒，50℃ 40秒，65℃ 50秒，35个循环；
65℃ 10分钟。
（总时间约170分钟）
电泳分析结果
1.
用1 ×TAE配制２%的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入GOLDVIEW(５ｕＬ /100mL),待凝胶冷却至50～70℃左右，倒入胶槽，等胶凝固后放在电泳装 置上；
b Carrier RNA工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液RL和
Carrier RNA溶液的体积，将裂解液RL与Carrier RNA溶液颠倒混匀 ，即得到Carrier RNA工作液。最好现用现配，工作液2-8℃保存不超
过48小时。
c 缓冲液GD、漂洗液RW 为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂 瓶上标注的量）混匀，室温可储存1年。
年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。能在一个试管内 将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至 十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研
究和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性
创举和里程碑。
PCR技术简史 PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史。 1971 年Korana最早提出核酸体外扩增的设想。1985年美国
引物、TaqMan探针、 dNTPs、 Taq聚合酶、 模板、 相应的缓冲体系等。
典型的Real time PCR四阶段:
荧光阈值(threshold)设定:

threshold = 10×SD(cycle 6-15)
Ct值：
C代表Cycle, t代表threshold,即每个反应管内的荧光 信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
实时荧光定量PCR定义：
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光
信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始
模板进行定量分析的方法。
分类(DNA 产物的荧光标记)：
非特异性荧光标记： 1、SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan 3、分子信标 (Molecular Beacon)
TaqMan---水解型杂交探针
① 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等；
② 3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)； ③ 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开， 发荧光； ④ Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针。
TaqMan法工作原理
TaqMan PCR体系的构成：
荧光定量PCR标准曲线绘制:
结果分析条件设定和结果判断:
对照结果：阴性对照应为阴性；阳性对照应为阳性； Ct值无数值的（与阴性对照应一致）标本为阴性样本； Ct值≤35.0的样本为阳性； Ct值≥35.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性， 否则为阳性。
3.咽拭子 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于 病原检测。用专用采样棉签,适度用力拭抹咽 后壁和两侧扁桃体部位,应避免触及舌部;迅速 将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理 盐水）的采样管中,在靠近顶端处折断棉签杆, 旋紧管盖并密封。
4.疱疹液
局部皮肤消毒后(建议使用75%酒精,不能
使用碘酒),用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱
5. 在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。
RT-PCR 质量控制
1. 2. 3. 提取RNA：选择一个EV71阳性标本同时提取作对照； PCR扩增：选择至少一个EV71阳性标本RNA同时扩增作对照； 电泳分析：选择合适的Marker （500～1000bp)
实时荧光定量PCR技术
传染病暴发疫情 应急检测
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一、实验室检测在传染病疫情中的作用
公共卫生立法
运行保障
科研
工作依托
教育培训
人才队伍
公共卫生
卫生监督 执法体系
疾病预防控制 体系
应急反应 体系
医疗救助 体系
四个体系
——国家突发公共卫生事件应急预案
一、实验室检测在传染病疫情中的作用
传 染 病 暴 发 疫 情 处 置 流 程
一、实验室检测在传染病疫情中的作用
遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖
RT-PCR基本原理
逆转录酶 DNA聚合酶
PCR扩增
mRNA
杂化双链
cDNA
提取核酸模板（病毒RNA模板为例）
RNA提取试剂盒方法
试剂准备(按照试剂盒说明书操作) ： a Carrier RNA储存液配制： Carrier RNA冻干粉溶解于无RNA酶水中 ，储存液的浓度一般为1 ug/uL，并进行分装，避免反复冻融。
接种至选择或鉴别性培养基。
无菌部位采集的脑脊液、血液等标本，可直接
接种至营养丰富的液体或固体培养基。
细菌的鉴定
生化鉴定：生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方法之一， 如糖发酵试验；现有多种微量、快速、半自动或全自动细 菌生化反应试剂盒和检测仪器,极大方便了菌株鉴定工作. 血清鉴定与分型：利用已知的特异抗体的诊断血清可以确 定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集实验，在数分钟内 能可得出结果。
7.脑脊液标本：出现神经系统症状的病例,要采集
脑脊液标本,进行病原和抗体检测。采集时间为出
现神经系统症状后3日内,采集量为1.0～2.0ml。
采集后立即装入无菌带垫圈的血清管中,旋紧管盖
并密封。
8.尿液采集：中段尿采集法，先用肥皂水清洗外阴
部，再以无菌水洗净，一般取首次晨尿的中段尿
10～20ml于无菌试管内。
9.尸体标本的采集：取尸体标本时每个标本用单独 的无菌活检针至少取1～2g感染部位标本，放入
单独的装有相应培养基的无菌容器中。
（二）标本运输
所有采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室,如
不能立即运送，用于细菌分离培养4℃保藏，病毒分 离－20℃以下低温冷冻保藏。
临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融,如果
三、现场快速微生物检查方法
直接涂片染色后镜检适用于形态和染色上具有特征 性的病原菌。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脓液
中发现革兰氏阳性葡萄串状球菌，咽喉假膜中有异
染颗粒的棒状杆菌及霍乱弧菌、艰难梭菌等。
优点是方便快捷，缺点是适用范围小。
四、实验室检测方法
1.病原分离
细菌的分离培养
有正常菌群存在部位所取标本（如粪便），应
接种细胞
病变观察(连续3代 ) 细胞病变 细胞无病变
阴性结果判定
血清学鉴定
分子生物 学鉴定
PCR RT-PCR / sequencing TaqMan RT-PCR DNA microarray NASBA LAMP ……
鉴
ELISA检测 免疫荧光 中和试验 血凝及抑止试验 补体结合试验...
结果判定
定
病毒形态学鉴定
正常细胞
病变细胞
观察CPE，常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、
溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。
A：正常Hep-2细胞； B：发生CPE后的 Hep-2细胞；
C：正常RD细胞；
D：发生CPE后的RD 细胞
2.核酸检测
RT-PCR检测方法
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80
2.
在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。 再加上5μl的PCR反应产物与之混合；
3.
将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加 到孔中；
4.
盖上盖子，接通电源，以 5V/cm 电压（恒定电压）电泳，大约35-40min， 直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；
不能确保－20℃的条件，应该在0～8℃运输和保存。
标本运输时要附有采送样登记表，包含必要信息,如
标本编号,发病日期和标本采集日期等。
三、现场快速微生物检查方法

直接从临床标本中检查微生物抗原


检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定
快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统


应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物
缺点：耗时长（需48～72h），过程繁琐。 优点：能获得病原菌，特异性为100%，是许多 细菌性传染病实验室确诊的最重要证据。 因此，在暴发疫情中要求尽可能进行病原菌 分离来获得实验室确诊证据。
病毒分离培养
动物接种
鸡胚培养
组织培养
病毒分离（细胞） 鉴定的一般流程
标本采集
标本处理
蚊虫标本、 血清、CSF、 尸检组织标 本