金免疫标记技术

讨论分析
制备高质量胶体金的注意事项
玻璃器皿必须彻底清洗， （1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃 器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿， 器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双 馏水冲洗后使用。 馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活 化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 试剂配制必须保持严格的纯净， （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用 双馏水或三馏水并去离子后配制， 双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的 试剂经超滤或微孔滤膜 经超滤或微孔滤膜（ m）过滤， 试剂经超滤或微孔滤膜（0.45 m）过滤，以除去其中 的聚合物和其它可能混入的杂质。 的聚合物和其它可能混入的杂质。
讨论分析
2．鞣酸—枸橼酸钠还原法 鞣酸— A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 HAuCl4水溶液 水溶液1ml加入 加入79ml双馏水中混匀 双馏水中混匀。 B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L 枸橼酸三钠4ml， 鞣酸0.7ml， K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。 K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。 将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将 液分别加热至60℃ B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变 液加入A液中，溶液变蓝， 成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。 成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需 要制备其它直径的金颗粒，则按表15要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字 调整鞣酸及K2CO3的用量 调整鞣酸及K2CO3的用量
吸水纸
C区 ： 羊 抗兔Ig 抗兔Ig
讨论分析
阴性结果
标本
T区：标准 抗原
G区：金标特异性抗体(兔型) 金标特异性抗体(兔型)
吸水纸 C区：羊抗 兔Ig
讨论分析
讨论分析
斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno 斑点金免疫渗滤测定法（ assay,DIGFA） －gold filtration assay,DIGFA）此法原 理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料， 理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为 渗滤装置。在加抗原（抗体） 迅速加抗体（ 渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（ 抗原），再加金标记第二抗体， ），再加金标记第二抗体 抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置 反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。 ，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此 方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（ 方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（ HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。 HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。
布置作业
1.实验报告 1.实验报告
思考题
金免疫法能测出抗体，如 金免疫法能测出抗体， 此简单、方便如何用荧光 此简单、 免疫能检测出吗？，下一 免疫能检测出吗？，下一 ？， 次课学习荧光免疫检测， 次课学习荧光免疫检测， 预习相关内容
讨论分析
胶体金的制备
1．枸橼酸三钠还原法 10nm胶体金粒的制备 胶体金粒的制备： 0.01％HAuCl4水溶液 水溶液100ml （1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml 加入1 枸橼酸三钠水溶液3ml 加热煮沸30min 3ml， 30min， ，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至 4℃，溶液呈红色。 4℃，溶液呈红色。 15nm胶体金颗粒的制备 胶体金颗粒的制备： 0.01％HAuCl4水溶液 （2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液 100ml，加入1 枸橼酸三钠水溶液2ml 加热煮沸15min 2ml， 15min～ 100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～ 30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml， 30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml， 混匀即可。 混匀即可。 15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备 （3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备 0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。 水溶液100ml ：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速 加入1 枸橼酸三钠水溶液4ml 2.5ml、1ml或0.75ml， 4ml、 加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续 煮沸约5min 出现橙红色。 5min， 煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为 15nm、18～20nm、30nm和 15nm、18～20nm、30nm和50nm
讨论分析 金标法
缺点
优点
灵敏度不如酶标技术 一般作为定性，不易定量。 一般作为定性，不易定量。
讨论分析
示踪剂：以胶体金为指示剂， 示踪剂：以胶体金为指示剂，本 身形成免疫分析过程后的颜色标记
符号显示结果
自带质控对照
快速：全部检测过程 快速： 20分钟 分钟。 仅需 3-20分钟。
简便、经济实用 简便、
讨论分析
制备高质量胶体金的注意事项 （3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2 配制胶体金溶液的pH以中性 以中性（ 较好。 ）较好。 氯金酸的质量要求上乘，杂质少。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好 是进口的。 是进口的。 氯金酸配成1 水溶液在4 （5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月 稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时， 稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时， 最好将整个小包装一次性溶解。 最好将整个小包装一次性溶解。
讨论分析
以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG NC膜上抗 HCG结 以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结 HCG为例 HCG与 膜上抗再加胶体金标记的抗-HCG抗体 抗体， 合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合 红色） 物（红色）
评价、 评价、考核
考核评分表
Faulk和 Faulk和 Taylor首 Taylor首 创胶体金标 记免疫电镜 技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
鞣酸 枸橼酸钠还原法 鞣酸 枸橼酸钠还原法 鞣酸 枸橼酸钠还原法 鞣酸 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 鞣酸—枸橼酸钠还原法 鞣酸—枸橼酸钠还原法 鞣酸 枸橼酸钠还原法 鞣酸 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法 枸橼酸钠还原法
讨论分析
根据不同 的还原剂 可以制备 大小不同 的胶体金 颗粒。 颗粒。常 用来制备 胶体金颗 粒的方法
枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法 枸橼酸三钠还原法
技能目标
树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度， 具有良好的职业素质和崇高的职业道德。
素质目标
任务对象
肺炎支原体抗体检测
任务过程
复习提问 2′ 2′ 30′ 40′ 10′ 5′ 1′
教 学 环 节
案例导入 讲解与示教 学生操作 讨论分析 评价、考核 评价、 课后思考题
案例导入
患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3 11岁 间断发热1 伴咳嗽3 患儿， 体温最高39 39。 病程第2 天。体温最高39。1度，病程第2天查血常 规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“ 规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿 奇霉素” 无明显改变， 奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳 为阵发性刺激性咳嗽，少痰， 嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提 双肺纹理增粗，右上肺片影。 示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血 常规仍正常。 常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体 所致？ 如何快速诊断？ 所致？ 如何快速诊断？
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、 枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒， 枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并 由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷， 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团 形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合， 形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋 白质的生物特性。 白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外， 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子 结合， SPA、PHA、ConA等 结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理 性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应， 性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结 合物的免疫和生物学特性， 合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫 组织学、病理学和细胞生物学等领域。 学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
讲解与示教
斑点金免疫层析法演示 肺炎支原体诊断试剂盒
一 洗 净 双 手
立 即 加
四
1
2
操作
1
加
？？结果 ？？结果
步骤5 15分钟读 步骤5：15分钟读 取结果
？？结果 ？？结果
学生操作
一位学生 操作演示
老师纠正 点评
学生分组 再操作
讨论分析
提出问题
为什么在小小的 试纸条上出现两条 红线就是阳性结果 ，如此简单、方便 的方法可靠吗？
可单份检测，稳定性好 可单份检测，
分类
讨论分析
斑点金免疫层析试验 夹心法 双抗原夹心法 双抗体夹心法 竞争法
讨论分析
双抗体夹心法
标本
G区：金标特异性 抗体(兔型) 抗体(兔型)
T区：特异 性抗体
吸水纸
C区 ： 羊 抗兔Ig 抗兔Ig
讨论分析
双抗体夹心法： 检测抗原
讨论分析
竞争法
阳性结果
标本
T区：标准 抗原 G区：金标特异性抗体( 金标特异性抗体( 兔型) 兔型)
有假阳性或假 阴性的可能吗？
如何检测出来 的，原理是什么？
讨论分析
胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique)
是以胶体金作为示 踪标记物， 踪标记物，应用于 抗原抗体反应的一 种新型免疫标记技 术。
讨论分析
胶 体 金 标 记 技 术
讨论分析
（一）金免疫检测原理
任务九 金免疫标记技术 金免疫标记技术
任务目标
1.掌握金免疫标记技术原理和分类 1.掌握金免疫标记技术原理和分类
知识目标 2.了解标记物的制备 2.了解标记物的制备
3.了解金免疫检测的临床应用 3.了解金免疫检测的临床应用 1.会金免疫标记物的制备操作 1.会金免疫标记物的制备操作 2.会熟练操作金免疫检测过程 2.会熟练操作金免疫检测过程
讨论分析
1971年 1971年
1978年 1978年
Geobegan等将 Geobegan等将 胶体金标记抗 体用于普通光 镜下检测B 镜下检测B淋 巴细脑表面膜 免疫球蛋白， 免疫球蛋白， 建立了光镜水 平的免疫金染 色。
近年来
胶体金标记技术 进一步发展应用 于免疫转印、 于免疫转印、流 式细胞术、 式细胞术、液相 免疫测定、 免疫测定、固相 斑点金／ 斑点金／银染色 及斑点金免疫渗 滤测定法等多种 标记免疫检测方 法