兰花组织培养和分子生物学研究进展 (1)

收稿日期:2008-08-04;修回日期:2008-09-21

作者简介:丁秋露(1986-),女,专业方向植物组织培养和分子生物学,E m ai:l q i u l u207@sohu co m;通讯作者:赵旵军,E ma i :l han j unzhao @163 co m 。

基金项目:教育部科学技术研究重点项目(206066);安徽省教育厅自然科学研究重点项目(2006K J 061A)

doi 10.3969/j issn 1008-9632.2010 02 076

兰花组织培养和分子生物学研究进展

丁秋露1

,赵旵军

2

(1 安徽师范大学分子生物学及生物技术研究所;2 安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000)

摘 要:兰科植物是开花植物中最大的家族之一,其科研和经济价值越来越受到全世界的重视。兰花的组织培养近年来发展迅速,对兰花组织培养中原球茎的诱导和培养基选择的国内外研究进行了综述;并对近年来应用分子标

记、转基因等分子生物学技术研究兰花的遗传多样性、系统分类和基因功能进行综述。关键词:兰花;组织培养;分子生物学;转基因中图分类号:Q 943.1

文献标识码:B

文章编号:1008-9632(2010)02-0076-04

Progress i n orchi d tissue culture and m olecular biology

D I N G Q iu lu ,Z HAO H an jun

(1 The I nstitute ofM olecular B iology and B i otec hno l ogy ,A nhui Nor m al U ni versity ;2 Co llege of L ife Scie nce ,A nhu iN or m al Un i versity ,Wuhu 241000,Chi na)

Ab stract :O rch i d is t he one o f t he larg est flo w er i ng plant f am ilies T he value of orch i d i n sc i entific research and econo m y has been pa i d m ore attenti on O rchi d tissue cu lt ure has been deve l oped quick l y T he prog ress i n orch i d tissue culture such as the o ri g in of pro t o cor m and cu lture mediu m se l ec tion w as su mm ar ized i n this rev ie w R esearches on phy l ogeneti c c lassifica ti on ,g enetic d i versity and gene f unc ti on o f orch i d ,genetic transfor m ation ,DNA mo lecu lar m arker techn i ques etc ,w ere also br i efly i ntroduced K ey word :orchi d ;tissue cu lture ;m o l ecular biology ;gene ti c transf o r m ati on

兰花是整个兰科植物(O rchi daceae)的总称。兰科植物是开花植物中最大的家族之一,而且是单子叶植物中最高度演化的一科,有6个亚科725属25000余种,广泛分布于全球各地。兰花在中国约有170个属1200余种,分布较为广泛,几乎全国各省都有。其中,青藏高原就有99属474种及9个变种,广东有71属208种[1-2]。

兰花不仅具有极高的观赏价值,还具有独特的食用和药用价值。兰花的根、叶、花、果、种子均有很高的药用价值。印度人曾经用兰花Erio p sis L indle y 治疗唇疮,同时其还可以舒缓牙龈和口腔黏膜的不适。不仅如此,兰花对于现代社会人类高发病症 癌症也有较好的功效[2]

。因此,兰花的组织培养及快速繁殖技术的发展以及基因功能的研究对促进人类的健康及医疗事业都有着重要的意义。1兰花组织培养的研究

1 1 兰花外植体的选择和原球茎的增殖

外植体的选择直接关系到原球茎的诱导。在组织

培养中幼嫩部位产生褐化较轻,所以一般选取较幼嫩且生长旺盛的部位。茎尖、叶片和种子是诱导原球茎的理想外植体来源。花瓣、萼片、子房、休眠芽、侧芽、花梗节间段、根尖等均可作为外植体诱导出原球茎[3]

。

1 1 1 茎尖和侧芽作为外植体

茎尖是最早也是使用频率最高的兰花外植体,侧芽应用也相当广泛。茎尖和侧芽顶端分生区细胞的分裂能力强,容易诱导出原球茎。大花蕙兰(Cymbi di um )、卡特丽亚兰(Cattleya )、石斛兰(D endrobiu m )、

墨兰和建兰[4]

等均成功用茎尖诱导出大量的原球茎。但对一些单茎性兰花,如利蝴蝶兰(Phalaeanopsis )、仙指甲兰(A erides )等用茎尖作为外植体有可能丧失母株,因此需要寻找其他外植体。经过对茎尖及侧芽的取材时间、部位及大小的研究,一般认为带1~2个

叶原基的茎圆锥成活率高,中间部位侧芽成活率也较高。

1 1

2 叶片作为外植体

叶片作为外植体既可减少对母株的伤害,取材又不受季节的限制,且数量多,是比较理想的外植体材料来源。但实验也表明虽然叶片也具有诱导出原球茎的能力,但成熟叶诱导出原球茎的能力极弱。幼叶诱导出原球茎的能力较成熟叶强,但诱导率也很低,对于大花蕙兰仅为3 3%左右[5]。

1 1 3 种子作为外植体

在自然条件下兰花种子虽多,但由于其不具有发育完全的胚,且种皮致密、透性差或种皮中含有抑制物使种子很难萌发。自N oel Ber nared在1899年创立了兰花种子共生萌发法后,研究者们接着发现大部分兰花种子也可以通过无菌萌发的方式进行,即非共生萌发。兰花种子的非共生萌发已在蝴蝶兰、石斛兰、文心兰等兰花中取得成功。2005年中国科学院昆明研究所首次利用种子成功的诱导出云南野生拖鞋兰和独蒜兰。由于种皮致密等原因,对部分兰花种子的预处理也有利于兰花种子的萌发。田梅生等用剪刀将四季兰种皮剪破后种子的萌发率大大提高。

1 1 4 花梗节间作为外植体

研究者们一般很少用花梗节间段作为外植体。鲁雪华、郭文杰等在2002年成功地用蝴蝶兰的花梗节间段诱导出原球茎,并且通过实验表明花梗节间段形成类原球茎的频率明显高于其它外植体(茎尖、根尖)。苏加乐等也成功利用蝴蝶兰的花梗节间段高效诱导出原球茎和增殖[3]。

1 1 5 根作为外植体

Ste wart等用树兰(Ep i dendrum)的根首次成功地培养出了原球茎和从愈伤组织分化出1株苗。后来,根的诱导相继在不同兰花中获得了成功。徐宏英等用大花蕙兰的幼根成功地进行组织培养,来检测其快速繁殖的影响因素[6]。但由于兰花的根部是共生菌根,所以根部作为外植体较难灭菌,在组织培养的过程中较容易污染。

1 2 组织培养基和添加物研究

1 2 1 组织培养基研究

兰花的组织培养中常用的培养基为M S、V W、KnudsonC、Kyoto、W hite和它们的改良型,应根据不同品种而选择合适的培养基。如对于大花蕙兰,M S,1/2 M S,VW,KC均可应用于原球茎的增殖,但以KC效果最好。M S培养基营养成分含量丰富,有利于增殖,不利于分化。Wh ite培养基的营养成分含量低,有利于分化。本实验小组正在选取不同的培养基对春兰和惠兰进行组织培养并取得一定进展。蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂,不同浓度对兰花原球茎的生长、分化影响较大。2%的蔗糖最有利于原球茎的生长,2%~3%的蔗糖促进芽的形成,而根的分化和生长则以5%的蔗糖最适合。无机盐用量也不尽相同,如春兰要求培养基中的无机盐量要少,墨兰要求的量较大[7]。培养基中使用的外源激素主要是生长素类(如I AA、2,4 D和NAA)和细胞分裂素类(如BA、Z T 和KT)。不同的兰花、不同的生长发育阶段所需激素的量和种类也不尽相同。

1 2 2 组织培养基添加物研究

适量的提取物,如在培养基中添加番茄汁、蛋白胨、酵母提取液、水解蛋白、苹果汁、香蕉汁等可促进兰花种子的萌发。附加香蕉泥对原球茎的增殖有明显的促进作用。香蕉匀浆物在KC培养基和Wh ite培养基是最适合原球茎增殖的添加物。水解酪蛋白对于原球茎的增殖有明显的促进作用[8]。另外,胰蛋白胨、酵母提取物和KC培养基一起使用对原球茎的增殖有促进作用,但酵母提取物在W hite培养基上使用,对原球茎的增殖却有抑制作用。

1 3 兰花组织培养与育种研究对开发兰花市场的推动作用

中国兰花种质资源非常丰富,但其主要是地生兰中的小花品种,所以与引进的洋兰相比其市场占有量很小。目前对兰花的研究主要集中在组织培养快速繁殖方面的研究,但兰花人工育种方面的研究相对来说很少。四川农科院的吴汉珠等进行国兰品种间的杂交研究获得的优良品种有十余个在中国兰花博览会上获得金奖,这些优良品种具有很好的市场。因此兰花的杂交育种的广泛研究与组织培养快速繁殖研究相结合必定会给中国兰花产业带来广阔的市场与经济价值。

2 兰花分子生物学研究进展

2 1分子系统学和生物多样性研究

应用RA PD等分子标记技术检测兰属品种间的亲缘关系是近些年来兰花分子系统学研究的重要手段,如梁红建等用RAPD分析技术对19个中国兰花进行品种鉴定和分类研究。随机引物扩增条带显示每个兰花品种都有其特有的扩增带可与其它品种区别。这种特异的条带可作为一个品种的分子标记而应用于品种鉴定。RAPD对基因组的分析结果与传统分类学的结果基本相符。李文等从55种10个碱基的随机引物中筛选出4种引物,扩增出93条多态性带分析兰属的亲缘关系。通过聚类分析表明,建兰、墨兰、春兰的亲缘关系较近,而春剑、寒兰、独占春和兔耳兰与建兰的亲缘关系较远。Cafasso等人利用位于叶绿体t RNA LEU内