益气温阳活血方对心肌梗死模型大鼠骨髓干细胞的动员作用和左室重构的影响

益气温阳活血方对心肌梗死模型大鼠骨髓干细胞的动员作用和左室重构的影响（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：杨庆有,陆曙,龚少愚,孙慧茹
【摘要】目的对比观察益气温阳活血方和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对心肌梗死模型大鼠骨髓干细胞的动员作用和左室重构的影响。

方法结扎冠脉前降支造模,检测模型鼠造模当天、第5天和第10天外周循环血干细胞数,计算治疗第8周大鼠心脏重量指数、室壁变薄率和膨胀指数。

结果中药组外周血干细胞数在造模5 d后显著升高(P0.001)；停药5 d后,仍高于西药组(P0.001)。

中药组心脏重量指数下降(P0.001),室壁变薄率升高,膨胀指数显著下降(分别为P0.05,P0.001)。

结论益气温阳活血方具有良好的动员骨髓干细胞作用,其动员作用较G-CSF持久；在防治心室重构方面有优于G-CSF 的趋势。

【关键词】心肌梗死；骨髓干细胞；左室重构；益气温阳活血方Abstract：Objective To contrast and observe the bone marrow stem mobilization induced by Yiqi Wenyang Huoxuefang and
G-CSF, and the influence to left ventricle reconstruction. Methods Model rat was made by ligate LAD, quantity of circulation stem cells (CSC) at the first, fifth and tenth day was detected. After be treated 8 weeks, the heart index, the expansion index and the thinning ratio were calculated. Results The quantity of CSC of Chinese herbs group increased at the fifth day (P0.001). After withdrawal medicine 5 days, it is higher than medicine group (P0.001). The heart index and the EI decreased remarkable (respectively P0.001 and P0.001), and TR elevated (P0.05). Conclusions Yiqi Wenyang Huoxuefang has a good mobilization effect on bone marrow stem cell, and is better than CSF. It has a better effect in inhibiting the left ventricle reconstruction of heart than CSF.
Key words：marrow stem cell；reconstruction of left ventricle；Yiqi Wenyang Huoxuefang
目前人们认识到：心肌细胞的丢失是心肌梗死后心衰发生的主要因素,心肌细胞数量的减少与病理性的心室重构导致心功能恶化是心衰发生发展的基本机制。

如何促进梗死区内心肌细胞再生和减少梗死邻近细胞的凋亡、防止心室重构,成为防治心梗后心力衰竭发生及降低心梗后远期死亡率的关键。

本实验对比观察了益气温阳活血方和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对骨髓干细胞的动员作用及其干预左室重构的作用。

1 实验材料
1.1 药物
基因重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)购于山东格兰百克制药有限公司。

益气温阳活血方由人参10 g,黄芪15 g,制附子5 g,毛冬青30 g,益母草10 g组成,购自广州中医药大学第一附属医院。

上述中药常规煎煮后离心,取上清液,水浴浓缩成1 mL(含原药材1 g),4 ℃保存备用。

1.2 仪器
L-200型电子分析天平(SHZMADZU Corporation KYO to JAPAN Altra),流式细胞仪(Beckman Counter.U.S.A),BI- 2000图像分析系统(成都泰盟科技有限公司),切片机(日本樱花株式会社),HH.W21.Cr42型恒温水浴箱(广东汕头医用设备厂),TDL-5A型飞鸽牌离心机(上海安亭科学仪器厂)等。

2 实验方法
2.1 动物分组和造模
纯种SPF级SD大鼠40只,4周龄,雌雄各半,体重(180±10)g,广州中医药大学实验动物中心提供。

40只大鼠先随机分出10只作为正常空白组,余下30只参照文献[1]方法结扎冠脉前降支造模。

造模后用卡西欧计算器给出的随机号随机分为3组：模型组、G-CSF 诱导组(西药组)、益气温阳活血方诱导组(中药组),每组10只。

2.2 治疗方法
造模当天开始治疗。

正常空白组：正常喂养,不作治疗；模型组：皮下注射生理盐水0.2 mL,生理盐水5 mL灌胃；西药组：生理盐水5 mL灌胃,皮下注射rhG-CSF 10 μg/(kg·d)[约0.2 mL/(鼠·d)]；中药组：皮下注射生理盐水0.2 mL,中药煎剂5 mL灌胃。

均为每日1次,连续5 d。

2.3 检测指标
2.3.1 骨髓干细胞动员的观察
造模后24 h、治疗第5天和第10天,眼眶取血,流式细胞仪检测血液中CD34＋细胞数量,按下式计算表达CD34＋的细胞数量[2]。

骨髓干细胞数=(测得CD34＋数/测得微球数)×(微球总量/样本体积)。

2.3.2 左室重构的观察
治疗第8周,各组大鼠称重,麻醉后取出心脏,冰盐水冲洗后吸干水分,称取心脏重量,计算心脏重量指数。

心脏指数=心脏重量(mg)/体重(g)。

剪除双侧心房及右心室,沿左心室长轴由心尖到心底部切成两半,以10%甲醛固定,乙醇脱水,石蜡包埋。

每隔100 μm切取2 μm厚的全心脏长轴面切片1张,共切6片。

冲洗后,HE染色,用BI-2000型图像分析系统进行图像分析,逐片测量下列参数：梗死区横断面积(IA)、梗死区室壁厚度(IT)、室间隔厚度(ST)、左室壁横断面积(LVA)、左室腔横断面积(LVCA)和左室腔周长。

按下式计算膨胀指数
(Expansion Index,EI)和变薄率(Thining Ratio,TR)。

EI=(LVCA/LVA)×(ST/IT)；TR=6张切片梗死区厚度之和/6张切片室间隔厚度之和。

2.4 统计学方法
数据均采用SPSS11.0软件包进行统计处理,以x±s表示,先行正态检验和方差齐性检验,再行单因素方差分析和t检验。

3 结果
(见表1～表3)表1 各组大鼠不同时段循环干细胞数(略)注：与正常空白组比较,*P0.01；与模型组比较,#P0.05,##P0.001；与西药组比较,△P0.001(下同)。

表2 造模8周后各组大鼠心脏重量和心脏重量指数(略)表3 造模8周后各组大鼠室壁变薄率和膨胀指数(略)
4 讨论
心肌梗死后骨髓干细胞动员能自行迁移到心肌损伤部位,在心脏微环境中横向分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞。

而且骨髓干细胞分化来的心肌细胞能与周围宿主心肌细胞形成有效的电-机械偶联[3],从而参与坏死心肌组织再生,改善心功能,实现心肌在结构和功能上的整合。

然而,一般情况下进入到外周循环血中并迁移到心梗区域的骨髓干细胞数极少,对坏死心肌组织的修复作用极为有限。

因此,采用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血,增加外周血干细胞数量,则有可能促进心肌组织的修复。

大量研究证实急性心梗后经动员的骨髓干细胞参与了梗死灶的组织修复和血管重
建。

常用的动员剂有G-CSF、血管内皮生长因子(VEGF)、基质源性生长因子-l(SDF-l)等。

进一步的研究还发现,这些动员剂多有发热、乏力、皮疹、胃肠道反应等不良反应,发生最多也最为严重的是“骨痛”,临床应用受到一定的限制[4]。

目前,国内外还没有应用中药动员骨髓干细胞治疗心肌梗死的研究。

本实验将益气温阳活血方对骨髓干细胞的动员作用与目前研究中普遍采用的G-CSF做了对比研究,结果显示：治疗5 d后中、西药组外周血干细胞增长了10倍,与Dulua[5]的研究结果相符合。

中药组循环干细胞数量少于西药组,但二者之间无统计学差异,说明中药也具有良好的动员干细胞作用；停药5 d后,中药组外周血干细胞数虽有下降,但仍维持在一个较高水平,与西药组相比差异显著。

提示中药动员干细胞作用较持久,这可能是中药组防治左室重构作用优于G-CSF组的原因之一。

动员自体骨髓干细胞迁移入缺血心肌中,骨髓干细胞将发生“环境依赖性分化”,分化成心肌样细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞。

相应地,在骨髓干细胞聚集的区域也形成一个特殊环境,原有受损的心肌细胞将发生“环境依赖性变化”,可能不发生或只是轻微玻璃样变性和凋亡的发生,心肌发生瘢痕化程度也较轻,也就是说,骨髓干细胞被动员并迁移入缺血心肌后从2个方面了防止了心肌细胞数量的减少。

本实验从宏观上观察到益气温阳活血方对心肌梗死模型大
鼠左室重构具有良好的干预作用,其具体作用机理还不清楚,可能与下列情况有关。

①药物动员的骨髓干细胞在心肌微环境中分化为心肌细胞,直接增加了心肌细胞数量,替代坏死心肌发挥功能；②定向迁移到损伤心肌处的干细胞形成局部微环境,减少了梗死相邻区域心肌细胞的凋亡,间接增加了心肌细胞数量；③可能通过分化为血管组织改善血供,最终抑制了梗死区室壁的变薄、延展,减少了存活心肌的代偿性肥大,抑制了心室重构。

从实验结果看,中药组防治左室重构的作用有优于西药组的趋势,提示研究应用中药动员骨髓干细胞防治心肌梗死后心衰具有良好的前景。

【参考文献】
[1] Martinez L, Carmona L, Villalobos-Molina R, et al. Vascular alpha ID-adrenoceptor function is maintained during congestive heart failure after myocardial infarction in the rat[J].Arch Med Res,1999,30(4)：290.
[2] 王建中.临床流式细胞分析[M].上海：上海科学技术出版社,2005. 589.
[3] Tang Y L, Zhao Q, Zhang Y C, et al. Autologous mesenchymal stem eel transplantation induce VEGF and bovascularization in ischemic myocardium[J].Regul Pept,2004,117(1)：3－10.
[4] 张明,崔丽杰,李占全,等.急性心肌梗死患者外周血干细胞动员效率及安全性观察[J].介入放射学杂志,2004,48(12)：89－92.
[5] Delua E. Prior chemotherapy does not prevent effective mobilization by G-CSF of peripheral blood progenitor cells Brit[J].Cancer,1992,66(8)：893－899.。