罗丹明内酰胺一氧化氮分子荧光探的应用研究

罗丹明内酰胺一氧化氮分子荧光探的 应用研究
导师：王明慧 0702010312 张振玉
主要内容
• 文献综述
• 实验部分
• 实验结果
• 致谢
文献综述
1研究内容
• 实验研究以罗丹明为骨架的NO近红外荧光分子探针，实 现体外和体内的NO实时、快速、高灵敏度、高选择性的 简便检测方法，同时对这类荧光分子探针的合成方法及发 光机理性能进行研究。
实验部分
• 反应方程式
C2H5 C2H5 N O C2H5 OH + O O
C2H5 O Cl SOCl2 O O C2H5 O Cl + Cl O NH2 NH2
甲苯 140℃
C2H5 N
O +
OH H2SO4 Cl
HOOC
C 2H 5 O Cl NH2 N O
N C2H5
N C2H5
N C2 H5
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用于NO检测的荧光分子探针的种类 1 含有金属离子的NO荧光探针 2邻苯二胺与NO的缩合反应 3氧化还原反应
• 荧光探针前景与展望 有机荧光探针作为重要精细化学品之一，以其独特的性能 在冶金、农业、考、矿物学、环境化学、药理学、生理学、 分子生物学、细胞生物学、分子学、单个分子检测、信息 科学、荧光标记、激光染料等越来越多的领域。近年来， 随着生命科学的不断发展，荧光探针己在蛋白质、核酸、 细胞检测及分析等方面起着举足轻重的作用，并具有广阔 的应用市场前景。随着及应用技术的不断改进，人们对有 机荧光化合物的认识和研究将不断深入，用范围也将不断 扩大，有机荧光探针的发展前景将越来越广阔
• 实验步骤
称取10 g间二乙胺基苯酚，放入250 mL圆底烧瓶中， 并加入10.8 g邻苯二甲酸酐；缓慢升温至105 ℃，温度升到105 ℃后，回流反 应10 h，10 h后，冷却至50 ℃以下，用饱和NaOH溶液调节反应液的pH至 11~12，升温至90 ℃，回流反应6 h，反应完后，冷却至常温过滤，得到滤饼， 把滤饼溶解在1000 mL水中，用20％的盐酸溶液，调节pH至6左右，在进行 一次抽滤，得到滤饼，并进行干燥，用无水乙醇进行重结晶，得到产品，并 对产品进行核磁共振分析和红外分析。 （2）罗丹明骨架的合成 在带机械搅拌、回流冷凝管和温度计的100 mL四 口烧瓶中投入5 g(约0．016 mol)KETO酸，于冰浴中加入25 mL硫酸溶解，待 完全溶解后冷却到5 ℃再分批加入2.05 g(约0.016 mol)间氯苯酚，然后开始升 温至60~70℃反应24 h。将反应液倒人约200 mI碎冰中。用36％NaOH溶液调 节pH值为9~10，过滤，冲洗滤饼至中性，然后将滤饼移人四口烧瓶中，加入 50 mL1％NaOH溶液。在60~100℃下反应6 h，趁热过滤，滤饼用95％乙醇 进行重结晶，得到粉红色固体产品。 （3）罗丹明螺旋内酰胺衍生物的合成 将1 g罗丹明溶于15ml的二氯亚砜 中，反应回流4 h，将二氯亚砜旋干得砖红色固体。将1.5 g其邻苯二胺溶于6 ml干燥的乙腈中，向其中加入8 ml三乙胺，将所得的酰氯溶于6 ml干燥的乙 腈，缓慢滴加到邻苯二胺的中，室温反应4 h，反应结束后将溶剂旋干的棕色 固体，并对产物进行柱层析得白色，用二氯甲烷或已腈混合溶剂再进行重结 晶，最终得到白色罗丹明螺旋内酰胺。
2研究背景
目前报道的大部分NO荧光分子探针中，大部分荧光 波长位于可见光区，对生物活体的损伤大，生物基质背景 干扰高，影响荧光分析的灵敏度和准确性。同时部分性能 相对较好的近红外荧光探针合成路线过于复杂、成本高。 因此，发展对NO有选择性反应、水溶性好、光稳定性高、 应用的pH范围宽、激发波长与发射波长在近红外光区的 荧光探针，对降低生物基质背景干扰、减少激发光对生物 活体的损伤、建立简便、特异、灵敏快速、且可精确定量 的荧光分析法具有重要意义。
• 荧光探针的分类
（1）罗丹明类荧光探针 （2）香豆素类荧光探针
（3）荧光素类荧光探针
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分子荧光探针在一氧化氮分析中的应用进展
一氧化氮作为一种重要的生物信使分子,在生命过程中发挥 着重要的生理作用,它普遍存在于脊椎动物各种细胞内,产 生于体内多种组织、细胞,包括血管内皮细胞、巨噬细胞、 平滑肌细胞等,一氧化氮作为一个“新奇”因素影响着植 物的生长、发育和防御,如一氧化氮对植物的呼吸作用、 光形态发生、种子萌发、根和叶片的生长发育衰老等生理 过程都有作用。一氧化氮在植物抗病反应和植物一氧化氮 信号传递方面的研究目前正受到广泛关注。因此一氧化氮 的检测对研究其生理和病理机制具有重要意义。
致谢
本文是在我的导师王明慧博士的悉心关怀和指导下完成的。整个 实验研究过程中，导师一直对此课题给予高度的关注，在知识、理论、 方法、实践等各方面适时给以指导帮助。导师在为人处事、生活作风 上为我们树立了楷模。他严谨的治学态度、一丝不苟的敬业精神和高 尚的人格都对我的一生有着重要的影响，将使我终生受益。在此，对 恩师的谆谆教诲表示深深的谢意和崇高的敬意！ 在整个实验过程中还得到了吕东泽师兄、陈云龙师兄和宫圆圆师 姐的热心指导和帮助，另外在实验中还得到了本组同学符玉龙、康健 无私的帮助，在此一并致以衷心的感谢！他们丰富的实验经验，娴熟 的实验技能，使我的实验事半功倍。在此，向各位表达我最诚挚的谢 意。
（1）KETO酸的合成
• 实验结果
罗丹明内酰胺红外谱图
罗百度文库明内酰胺1H NMR谱图
• 结论
用邻苯二甲酸酐和间羟基-N,N-二乙基苯胺反应合成出KETO酸， 反应条件为：缓慢升温至105 ℃，温度升到105 ℃后，回流反应10 h， 冷却至50℃后再用饱和氢氧化钠调节PH到11~12，在90℃下反应6h。 冷却，常温过滤，再用盐酸过滤用无水乙醇重结晶。KETO酸与间氯 苯酚反应得到罗丹明骨架，反应条件为：60~70℃反应24h。尝试与 邻苯二胺反应得到罗丹明的螺旋内酰胺。合成出一系列罗丹明螺旋内 酰胺衍生物，反应条件为：室温下搅拌反应4 h。粗产物用层析柱进 行分离提纯，用二氯甲烷或已腈混合溶剂再进行重结晶，最终得到白 色产物罗丹明螺旋内酰胺衍生物。
4荧光探针
荧光探针的定义 荧光探针的分类 分子荧光探针在一氧化氮分析中的应用进展 用于NO检测的荧光分子探针的种类 荧光探针前景与展望
• 荧光探针的定义
当用紫外光或可见光照射某些物质时，这些物质吸收 了某种波长的光后射出波长和强度各不相同的光线，当停 止照射后，这种光也随之消失，这被称为荧光。 荧光探针定义为能和个别组织特异结合而又不干扰其 他组织成分自身荧光的那些荧光化合物，为了和细胞中天 然的自发荧光物质相区别，人们也曾称染料为次级荧光体， 相应地把这种染色过程称为次级染色，把像叶琳这样荧光 物质称为初级荧光体。而现在把所有的荧光探针，不管其 染色性能和对天然荧光的影响如何，都统称作荧光探针
3主要研究内容
本实验以邻苯二甲酸酐与间羟基-N,N-二乙基苯胺反 应合成出KETO酸，然后KETO酸与间氯苯酚反应得到罗 丹明骨架，尝试与邻苯二胺反应得到罗丹明的螺旋内酰胺。 合成出一系列罗丹明螺旋内酰胺衍生物，选择出激发和发 射波长长、在生理条件下灵敏度高、选择性好的化合物作 为荧光分子探针在细胞和组织中检测和定量NO。