第五章酶的非水相催化

低于最适水量
当水含量远低于最适水量时由于有机溶剂缺 乏提供形成多种氢键的能力加之介电常数较 低导致酶蛋白分子内强烈的静电作用此时氢 键作用主要体现在酶分子内部氨基酸残基处 于一种紧密堆积状态这种过于刚性的结构虽 然可以使酶在无水有机溶剂中保持二级结构 不变但已无 法表现出催化活力

高于最适水量
关联酶催化性质的溶剂性质参数 有:
疏水性、
介电常数、
偶极矩、
溶剂的水溶性、
底物和产物在溶剂水中的分配系数
第三节 酶在有机介质中的催化特性
一、底物专一性
在水溶液中，底物与酶分 子活性中心的结合主要依 靠疏水作用。 一般，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较 强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶 剂中，疏水性较弱的底物容易反应。
生物催化剂的环境调控技术
通过“环境调控”技术，实现
生物催化剂活性、选择性的人为控制
生物催化剂环境的改变： 会导致酶的结构构象的改变 进而酶的活性、选择性改变
第一节 酶非水相催化的研究概况 非水介质的组成
有机溶剂 超临界流体 气相介质 低共熔混合体系：两种或多种固体化合物混 合而得到的具有一个最低共熔点的状态。
三、超临界流体介质中的酶催化
超临界流体( Supercritical Fluid ,SCF) ：温度和压力 超过某物质超临界点的流体。
常见SCF：CO2 (Tc=31℃，Pc=7.3atm)、H2O (Tc=374℃， Pc=218atm)、氨、甲醇、乙醇、乙烯....
*
Pressure/(P)
Pc
4学时
非水介质酶催化
20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂 中仍具有活性。 1984年， A.M.Klibanov在Science上发 表“Enzymatic Catalysis in Organic Media at 100℃” ，使原来认为生物催 化必须在水溶液中进行的酶学概念发生 了革命性的变化。
K 1，2 =（kcat/Km ）1/（kcat/Km ）2与溶剂的疏水
性相关
五、热稳定性
a. 热稳定性提高
猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在 100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高 几倍
b. 储存稳定性提高
胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几 天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。

一、有机介质中的酶催化
酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的 催化反应。
适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物 质的酶催化作用。
酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异 性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳 定性等都有所改变。
二、气相介质中的酶催化
适用于底物是气体或者能够转化为气体 的物质的酶催化反应。
1、有机溶剂对酶结构与功能的影响
在有机溶剂中，某些酶的空间结构会受到破坏， 因此酶在有机溶剂中进行催化反应，通常要将 酶在加有保护剂的情况下进行冷冻干燥。 （1）有机溶剂对酶分子表面结构的影响 （2）有机溶减少酶活性中心数量（降低活性 中心极性、增大Km，破坏键，去折叠）
2、有机溶剂对酶活性的影响 P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。 极性系数lgP越大，表明其极性越小。
酶构象的刚性增加，稳定性提高；水的缺少 使得酶分子中肽键水解、二硫键破坏、氨基 酸异构化等无法进行。
六、 pH记忆和分子印迹特性
pH记忆：有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或
吸附到载体上之前所在缓冲液中的pH时的状态。
（酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值， 因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻 干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。）
极性较强有机溶剂，会夺取酶分子的结合水， 影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的 催化活性，甚至引起变性失活。
极性系数lgP＜2的极性溶剂一般不适宜作为 有机介质酶催化溶剂使用。
3、有机溶剂对底物和产物分配的影响 有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物 的浓度。 若有机溶剂极性小，则疏水性底物在其中溶解 度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需 水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度因此 较低，酶的催化速度低。反之，则疏水水性底 物溶解度低，也会使催化速度减慢。 一般选用2≤ lgP ≤5的有机 溶剂作为有机介质为 宜。
溶剂中催化活力选择性有变化

一些酶在不同的溶剂中催化活力、选择性有 较大的变化. 这是因为在非水介质中酶的空间 结构会发生一定的变化, 而且酶与底物之间成 键自由能也会发生变化. 这就会使一些本来在 水中不能和不容易进行的反应可以在有机相 中较容易地发生.
水溶液：疏水作用 非水介质：酶和底物结合的自由能；酶和水分 子结合的自由能；底物在反应介质-酶活性中心 的分配

反之当水含量远高于最适水量时大量的水分 子与酶分子形成分子间氢键此时酶处于一种 十分松散的状态柔性过大使酶的构象易于改 变这就解释了为什么在水/有机混合溶剂中酶 的二级结构会变化并最终导致酶的变性失活 只有在最适水量附近时酶才处于一种刚柔适 度的状态表现高的催化活性
三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响
26
庚猪 醇胰 的脂 转肪 酯催 反化 应甘 油 三 丁 酸 酯 和 正
必需水
3、水活度 可以认为，在有机介质体系中，结合水是影 响酶催化活性的关键因素。 不同的酶有不同的最佳水活度。
水活度

决定酶催化活性的是酶蛋白的动态结构即由静电力 疏水力范德华力和氢键等共同参与维持的瞬态构象 水分子作为一种分子润滑剂 能直接或间接地参与这 些非共价作用使酶活性中心结构显现一定的柔性从 而起到对酶分子构象的调节作用因此对酶活性来说 有机溶剂中存在一最适水量
Protein and Enzyme
Engineering 蛋白质与酶工程 xsp6210@
第 七 章

酶的非水相催化
酶化工

通过生物的高兼容性、手性产品等新材料、 新产品的开发和广泛应用, 可以逐渐改变现有 高能耗、高污染的生产结构和消费结构.生物 催化的广泛应用将会给人们提供性能更佳的 材料和能源. 以可再生的生物原料为基础的生 物生产过程将逐步取代化石原料生产过程, 成 为21 世纪化工生产的主体, 从而实现绿色化 工、绿色生产的目标.
枯草杆菌蛋白酶催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙 酰-L-苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应，在极性较 弱的二氯甲烷或苯介质中，含丝氨酸的底物优先 反应，而在极性较强的吡啶或季丁醇介质中，含 苯丙氨酸的底物优先反应。
二、对映体选择性
又称立体选择性，是酶在对称的外消旋化 合物中识别一种异构体的能力大小的指标。
K LD
= （kcat/Km ）L/（kcat/Km ）D
K LD ——立体选择系数 kcat ——酶的转换数，是酶催化效率的一个指标， 是每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选 择性越强。 一般，酶在水溶液中催化的立体选择性较强。
三、区域选择性
即酶能够选择底物分子中某一区域的基 团优先进行反应。 区域选择性的强弱可以用区域选择系数 K rs的大小来衡量。
Solid
Liquid
Supercritic al Region
Critical Point
Gas Triple Point
Tc
超临界流体的有关性质

（1）超临界流体的P-V-T性质
乙烷 丙烷 丁烷 戊烷 乙烯 氨 CO2 二氧化 硫 水
流体名称
临界温度 （℃）
32.3
96.9
150.0
296.7
9.9
132.4
31.1
157.6
374.3
临界压力 （Mpa）
4.26
3.8
3.38
5.12
11.28
7.38
7.88
22.11
4.88
临界密度 (g/cm3)
0.220
0.228
0.232
0.227
0.23 6
0.460
0.525
0.326
0.203
用于酶催化反应的超临界流体应具备以 下条件：
非水介质中的酶催化反应具有以下优点：
（1）提高有机底物的溶解度； （2）酶的热稳定性显著提高； （3）使某些反应的热力学平衡向合成的方 向移动（如酯键与肽键的形成等）； （4）抑制了水参加的副反应（如肽水解 等）； （5）产物易于分离纯化； （6）酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用； （7）防止微生物的污染等。
第二节 有机介质体系中水和 有机溶剂对酶催化反应的影响
一、有机介质反应体系 1、微水介质（microaqueous media）体系 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系
3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相 体系
催化反应通常在两相的界面进行。一般适用 于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化 合物的催化反应。
4、正胶束体系
在大量水溶液中含有少 量与水不相混溶的有机 溶剂，加入表面活性剂 后形成的水包油的微小 液滴。 5、反胶束（reversed micelle）体系
在大量与水不相混溶的有 机溶剂中，含有少量的水 溶液，加入表面活性剂后 形成的油包水的微小液滴。
二、水对有机介质中酶催化的影响
1、水对酶分子空间构象的影响 酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空 间构象。 维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水 量称为必需水。 2、水对酶催化反应速度的影响 在催化反应速度达到最大时的水含量称为最 适水含量。
对酶的结构没有破坏作用； 对催化作用没有明显的不良影响； 具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性； 超临界温度不应太高或太低；
超临界压力不能太高；
超临界流体容易获得，价格便宜。
四、离子液介质中的酶催化
离子液：由有机阳离子与有机（无机）阴离子 构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥 发性好、稳定性好。 室温离子液体是一类可广泛用于有机合成,无机 及高分子合成的优质溶剂,其典型组成是含氮有 机阳离子和无机阴离子.美国匹茨堡大学首次报 道了室温离子用于酶催化反应.在离子液体中用 一种叫做hermolysin的蛋白水解酶催化两种氨基 酸的衍生物合成了人造甜味素阿斯巴糖的前体。
思考题
6.酶在非水介质中的催化反应有什么优点？ 7.非水介质中酶催化反应的特征是什么？ 8有机溶剂中如何调节酶的催化活性和选择性？ 9.非水相中常用的酶和反应类型有哪些？ 10.非水相酶促催化在工业上重要的应用有哪些？ 11.何为超临界流体？超临界流体中酶催化有哪些特点？
教学内容
7.1酶非水相催化的研究概况 7.2有机介质体系中水和有机溶剂对酶催
有机介质中酶催化的应用

食品添加剂的生产、多肽的合成 甾体转化、生物能源、


手性药物的拆分、手性高分子聚合物的制备
酚树脂的合成 导电有机聚合物的合成 发光有机聚合物的合成
思考题
1.何为非水相？常见非水相酶促反应体系有哪些？非 水相中酶的特性和酶促反应的特点是什么？ 2.什么是必需水和水活度？水在酶促反应中的作用？ 水是如何影响非水相中酶的特性？ 3.为什么在非水相中仍然可以保持酶催化活性和稳定 性？ 4.分析logP与酶活性之间的关系。 5.酶促反应非水介质主要包括哪些反应系统？其中最 常用的是哪一种？

热点：介质工程、溶剂工程 改变反应介质来改变酶催化反应的选择性， 从而达到人为的改变和控制酶的立体专一性。
二 活性
刚-பைடு நூலகம்并存
刚性：生物大分子结构的精确性
柔性：生物大分子局部区域具有一定的可
运动性。
有机相酶反应的优点：
（1）提高有机底物的溶解度； （2）酶的热稳定性显著提高； （3）使某些反应的热力学平衡向合成的方向 移动（如酯键与肽键的形成等）； （4）抑制了水参加的副反应（如肽水解等）； （5）产物易于分离纯化； （6）酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用； （7）防止微生物的污染等。
化反应的影响 7.3酶在有机介质中的催化特性
[教学目的] 掌握全新热点：介质工程——非水酶学的理论与应用。
[重点与难点]
1有机介质中酶促反应的特点 ； 2酶在有机溶剂反应体系中催化反应的影响因素及其 表现出的新性质。 [课堂教学设计] 讲授和自学相结合。生产科研实例导入，提问了解 学情，组织互动讨论。 [教学时数]
应用：控制有机相中酶催化的最适pH 酶在冻干前可用配体作印迹。
竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化， 而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的 高度刚性而得到保持。