人上睑眶隔脂肪来源的脂肪干细胞的分离培养及鉴定

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。

Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。

研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。

人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。

本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。

1材料与方法
1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。

1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。

1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。

把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。

室温下离心（1200r/min）10min。

离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。

吸取上、中层丢弃。

加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。

将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。

弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。

48h后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每3天换液1次，待细胞融合80％~90％时进行下一次传代。

在传代过程中采用差速贴壁法纯化ADSCs，即加入胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，经吹打、离心后，以细胞密度1.0×105mL-1接种在培养瓶内，置于孵箱内培养，4h后弃掉培养皿内DMEM培养基，细胞换液1次，继续在37℃、5%CO2条件下培养。

1.4ADSCs的鉴定
1.4.1细胞形态观察（HE染色）取第3代细胞，以细胞密度5.0×104mL-1接种于12孔细胞培养板上，用细胞爬片法使细胞生长到盖玻片上，培养一段时间，待细胞长满盖玻片，取出，用PBS冲洗3次，将长有细胞的盖玻片放入95%乙醇中固定15min；PBS冲洗2次，每次1min；浸入到苏木紫中染色5~10min；用自来水冲洗干净，浸入到稀盐酸乙醇溶液中进行分色，数秒钟即可；再用自来水浸洗，然后侵入到淡氨水中，使细胞核蓝化3~5min；自来水冲洗，浸入伊红染液中染色3~5min；自来水冲洗，然后经70%、80%、90%乙醇脱水各1次，95%乙醇2次和100%乙醇3次逐级脱水，各1min；二甲苯透明3次，每次1min。

然后用中性树胶封
人上睑眶隔脂肪来源的脂肪干细胞的分离培养及鉴定
范开防，王国栋，刘兴龙，杨彪炳（潍坊医学院整形外科研究所，山东潍坊261041）
【摘要】目的探讨人上睑眶隔来源的脂肪提取脂肪干细胞（ADSCs）的可行性，并进行分离、培养及鉴定。

方法取健康成年人上睑眶隔脂肪组织，用胰酶进行消化后收集细胞接种于培养瓶内，采用差速贴壁法纯化细胞。

用HE染色、免疫荧光进行细胞鉴定，并进行成脂、成软骨诱导。

结果HE染色显示细胞形态为长梭形，呈漩涡状生长。

免疫荧光鉴定结果显示细胞表面抗原CD44、CD29阳性表达，CD106、CD34阴性表达，说明分离培养的细胞是脂肪干细胞。

成脂、成骨诱导实验证明所得细胞有多向分化的能力。

结论可以从人上睑眶隔脂肪组织提取出ADSCs，并有多向分化能力，为今后ADSCs的取材提供了新的路径。

【关键词】干细胞；脂细胞；脂肪组织；眼睑；细胞，培养的；分离；鉴定
文章编号：1009-5519（2012）19-2881-02中图法分类号：R457.7文献标识码：A
Isolation culture and identification of adipose-derived stem cells separated from upper eyelid orbit septum fat of human beings Fan Kaifang，Wang Guodong，Liu Xinglong，Yang Biaobing（Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College，Weifang，Shandong261041，China）
【Abstract】Objective To investigate the feasibility of extracting adipose-derived stem cells（ADSCs）from the human upper eyelid orbital fat tissue and to perform the isolation，culture and identification.Methods The upper eyelid orbital fat tis-sues of healthy adults were collected.After digestion by trypsin，the collected cells were seeded in culture flask and purified by differential adherence method.These cells were identified by HE staining and immunofluorescence，and performed the adipose and cartilage induction.Results These cells were long fusiform shape and swirling growth by HE staining.The immunofluores-cence showed that these cells were positive for CD44and CD29and negative for CD106and CD34.Adipogenic and cartilage in-duction experiments indicated that these cells were capable of multilineage differentiation.Conclusion It is feasible that ex-tracting ADSCs from the human upper eyelid or bital fat tissue and ADSCs have the multipotent differentiation ability，which provides a new approach to obtain ADSCs in the future.
【Key words】Stem cells；Adipocytes；Adipose tissue；Eyelids；Cells，cultured；Isolation；Identification
基金项目：山东省高等学校科技计划资助项目（J09LF20）。

通讯作者：杨彪炳（E-mail：Ybiaobing@）。

片，在电子显微镜下观察并拍照。

1.4.2MTT 生长曲线测定取第3代细胞，待细胞长至80%~90%
融合后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度2.5×104mL -1接种到96孔培养板中。

每组设5个复孔，1个空白对照孔，共接种8块培养板。

每天取1块培养板在酶联免疫检测仪OD 490nm 处测量各孔的吸光值。

以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.4.3免疫荧光染色采用常规免疫荧光法进行ADSCs 表面标
志鉴定，取第3代细胞进行爬片，以细胞密度2.0×104
mL -1
接种于
24孔板中，每孔加入500μL DMEM 培养基，置于37.0℃、5%CO 2
培养箱内培养，待细胞60%~70%融合后进行细胞鉴定。

取4孔细胞，弃去DMEM 培养基后用PBS 冲洗3遍，用滤纸吸干细胞表面液体。

然后加入4%多聚甲醛500μL 固定10min ，再用PBS 冲洗
3遍。

加入山羊血清封闭液室温孵育30min ，弃封闭液，滤纸吸干
细胞表面液体。

分别向4孔内滴入一抗CD29、CD44、CD34及
CD106兔抗人多克隆抗体300μL （1∶100），4℃孵育过夜（14~16h ）。

第2天弃一抗，PBS 冲洗3遍，每孔加入山羊抗兔异硫氰酸荧光素（FITC ）标记的二抗300μL （1∶200），室温避光孵育2h ，弃二抗，PBS 冲洗3遍，每次15min ，甘油封片，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.4.4成脂、成骨诱导实验（1）向脂肪细胞诱导分化：取第3代细胞接种于12孔培养板中，第2天弃DMEM 培养基，换含有胰岛素10mg/L 、吲哚美辛0.2mmol/L 、伊菠丁基甲基黄嘌呤（IBMX ）
0.5mmol/L 、地塞米松1μmol/L 的DMEM 诱导液诱导培养1周左
右，用油红O 染色鉴定。

（2）向成骨细胞诱导分化：取第3代细胞接种于12孔培养板中，第2天弃DMEM 培养基，换含有维生素C
50μmol/L 、β磷酸甘油钠10mmol/L 、地塞米松10μmol/L 的DMEM 诱导液诱导培养，每3天换1次液，3周后行茜素红染色。

2结
果
2.1
ADSCs 形态学观察
倒置显微镜下观察经消化后搜集到的
原代细胞起初为透亮的小圆形，4h 后开始贴壁，贴壁后的细胞逐渐伸展开，体积也随之增大，多为短梭形或小多角形，24h 后存活细胞基本贴壁。

4d 左右可见细胞开始分裂增殖，随着时间的延长细胞逐渐伸展成长梭形外观。

7d 左右细胞铺满瓶底，呈鱼群样或螺旋状生长（图1）。

经传代后，细胞形态均匀，以长梭形为主。

核居中，多数为1个核仁，也有少数双核，核呈圆形或椭圆形。

随着传代次数的增加及用差速贴壁法进行细胞纯化，混杂生长的细胞逐渐减少，传至第3代细胞时能得到较纯的ADSCs 。

取第3代细胞进行HE 染色观察显示，细胞核为蓝色，胞质为红色，形态多为长梭形，呈漩涡状生长（图2）。

2.2MTT 生长曲线检测结果ADSCs 生长曲线呈S 型，第1~2
天细胞处于停滞期，从第3天开始细胞进入迅速生长期，第6天达到增殖顶峰，第8天后进入平台期（图3），结果均与以往研究
相一致[2]。

2.3免疫荧光表面标记鉴定
细胞表面抗原CD29、CD44呈阳
性表达，CD34、CD106呈阴性表达（图4），说明分离培养的细胞是
ADSCs 。

2.4ADSCs 多向诱导分化ADSCs 向脂肪细胞诱导分化1周
后，油红O 染色显示可见细胞内有红色大小不等的脂滴形成。

向成骨细胞诱导3周后，细胞分泌大量的胞外基质，聚集成钙化结节（图5）。

图3ADSCs 生长曲线
时间（d ）
O D 值
ADSCs 生长曲线
1
23
45
678
0.10
0.150.200.250.30系列
1
图1倒置显微镜下原代ADSCs 形态（×50）
A ：原代ADSCs 第4天；
B ：原代ADSCs 第
7天。

A B
：A ：HE 染色第3代ADSCs （×50）；B ：HE 染色第3代ADSCs （×100
）。

图2第3代ADSCs HE 染色
A
B
图5
ADSCs 向成脂、成骨细胞诱导（×100）
A ：成脂诱导1周；
B ：成软骨诱导3周。

A
B A ：CD29阳性表达；B ：CD44阳性表达；
C ：CD34阴性表达；
D ：CD106阴性表达。

A
B
C
D
图4免疫荧光表面标记鉴定（×200）
（下转第2885页）
3讨论
目前，对干细胞的研究一直是细胞研究领域的热点，骨髓间充质干细胞是其中热点之一，但骨髓的提取会给患者带来很大的痛苦及伤害，在取材上受到很大的限制；而且骨髓间充质干细胞体外纯化率较低，干细胞的分化能力随供体年龄增长而下降，特别不适合老年性疾病的治疗[3-5]。

因此，许多学者力求以新的种子细胞取代骨髓间充质干细胞。

ADSCs凭借其来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速、生物学性状稳定等优点，已成为细胞移植及组织工程理想的种子细胞[6-8]。

人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，然而吸脂术得到的脂肪会经过加热液化的过程，给细胞存活和培养带来不利影响。

随着人们对整形美容手术的认识及接受，整形美容业得到迅猛发展，手术种类及数量不断扩大，重睑术作为整形美容手术的常规手术也随着整形美容业的发展手术例数倍增。

重睑术后得到的眶隔脂肪是比较理想的脂肪来源途径。

本研究经患者同意，对重睑术所得的上眼睑眶隔脂肪组织，经过消化、培养及传代纯化细胞后，能得到较纯的ADSCs。

通过免疫荧光鉴定其表面标志结果与以往研究结果相一致[9-10]，CD44、CD29阳性表达，而CD34、CD106阴性表达。

成脂、成骨诱导实验证明，所得细胞有多向分化的能力，各项指标表明上眼睑眶隔脂肪提取的细胞为ADSCs。

为今后人ADSCs的取材提供了新的路径，也为进一步作为种子细胞在组织工程中的应用研究奠定了基础。

参考文献
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（收稿日期：2012-06-27）
3讨论
3.1BPH是以排尿不畅为主要表现的老年男性泌尿系统常见疾病，手术是其有效的治疗方法，除开放性手术外，TURP是一种安全、有效、对患者打击小、痛苦少的手术方法。

3.2BPH老年患者精神紧张、焦虑、手术创伤、术后留置气囊导尿管对下尿路的刺激、膀胱冲洗等因素均可诱发膀胱痉挛，增加了患者痛苦。

由于膀胱痉挛，膀胱逼尿肌收缩，引起膀胱内压增高，使膀胱静脉回流产生障碍，以及膀胱颈前列腺窝创缘反复被牵拉均可引起继发性出血，影响病情的恢复。

因此，手术前、后对患者进行心理安慰，增强患者的信心，解除其焦虑和紧张情绪十分必要[6-7]。

有严重不稳定性膀胱及低顺应性膀胱者术后易发生膀胱痉挛且症状较重，对该类患者术后可保留硬膜外麻醉导管；对膀胱痉挛症状较轻者可经肛门给予消炎止痛栓，也可获得缓解疼痛的效果。

手术前、后的护理是预防和减少膀胱痉挛的有效手段[6，8-9]。

3.3严格掌握手术禁忌证。

患者年龄大、并发症多，每天应监测血压，根据血压情况按医嘱给予降压药，并观察效果和用药反应。

术前应遵医嘱给予综合治疗、积极处理各种并发疾病，应用强心利尿剂及活血化瘀、扩冠药物改善心功能，控制心率失常[4]。

糖尿病患者尿糖控制在8.0mmol/L以下，餐后血糖10.0mmol/L以下，可改善肾功能，使各系统并发疾病得到稳定控制后再进行手术[10-12]。

3.4本研究对PKRP患者在常规护理基础上采取调节导尿管气囊注水量、膀胱冲洗液温度，术后硬膜外镇痛泵及镇静药物的应用等针对性护理干预措施，结果显示，干预组手术时间、术后镇痛剂使用率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），血尿、膀胱痉挛、尿液反流等发生例数均明显少于对照组，住院医疗费用较对照组明显减少，护理满意度较对照组明显提高，差异均有统计学意义（P<0.05）。

PKRP术后采用积极而有针对性的护理干预，可降低膀胱痉挛发生率，缩短血尿转清时间，从而减少术后并发症的发生，促进患者早日康复出院。

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（收稿日期：2012-05-23）
（上接第2882页）。