黄酮、多酚和抗氧化

1、总黄酮含量(硝酸铝～亚硝酸钠比色法，以芦丁计)
芦丁标准标准溶液的配制：准确称取经105 ℃干燥至恒重的芦丁标准品15.0 mg（精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至100 mL，配成150 μg/mL 的芦丁标准溶液，制备标准曲线。

精密称取一定量的测定样品，用30 %的乙醇溶液溶解定容至100 mL，取1 mL的待测液，加入30 %乙醇溶液至5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，混匀后放置5 min，加入10 %硝酸铝溶液0.3 mL，混匀后放置6 min，加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，用30 %乙醇定容至10 mL，静置10分钟，以零管为空白，摇匀后用1 cm的比色杯，在510 nm的波长处测定吸光度，并根据芦丁的标准曲线计算试样的总黄酮含量。

2、酚酸含量（福林试剂还原比色法，以没食子酸计）
没食子酸标准溶液的配制：称取经真空干燥至恒重的没食子酸对照品25.0 mg，用30 %的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，配成0.250 mg/mL的没食子酸标准溶液，制备标准曲线。

精密称取一定量的测定样品，用30 %的乙醇溶液溶解、定容，并稀释至适宜浓度，记录总体积。

取0.1 mL样品，并用水稀释至5.0 mL，各加入0.5 mL 未稀释的福林试剂，混匀后静置8 min，加入1.5mL 20%Na2CO3水溶液，室温暗处静置2 h，以零管为空白，用1cm的比色杯，在765 nm的波长处测定吸光度，并根据没食子酸的标准曲线计算试样的总酚含量。

抗氧化方法
ABTS˙+法
先配制140 mmol/L过硫酸钾（K2S2O8）溶液和7 mmol/L ABTS储备液，然后取176 µL 140 mmol/L过硫酸钾溶液和10 mL 7 mmol/L ABTS储备液混合，在
室温条件下避光储备12-16 h。

测定之前加入乙醇将ABTS˙+溶液稀释至吸光值为0.700±0.02（734 nm）下将3.9 mL 的ABTS˙+溶液与0.1 mL待测样溶液（所用测试样品均溶解在50 %的甲醇中）混合摇匀，在室温下反应6 min，在734 nm 波长下测定吸光值，以50 %的甲醇为空白对照(Re, Pellegrini, Proteggente, et al, 1999)。

根据下列公式计算每种待测样品对ABTS自由基的清除率∶
抑制率（%）= (A
空白– A
样品
)/A
空白
×100%
以待测样品浓度为横坐标，清除率值为纵坐标绘制待测样品清除ABTS自由基的曲线。

根据曲线的线性回归方程，计算得到ABTS自由基清除率为50%时的待测样品浓度，定义为半抑制浓度（IC50），所有实验重复三次。

DPPH·法
准确称取DPPH试剂20 mg，用无水乙醇溶解至500 mL容量瓶中，摇匀得0.101 mmol/L。

取待测样溶液0.1 mL（所用测试样品均溶解在50 %的甲醇中）和3.9 mL DPPH溶液混合摇匀，在室温下反应1 h，在517 nm波长下测定吸光度，以50 %甲醇为空白对照（Turkoglu et al, 2007）。

根据下列公式计算每种待测样品对DPPH自由基的清除率∶
抑制率（%）= (A
空白– A
样品
)/A
空白
×100%
以待测样品浓度为横坐标，清除率值为纵坐标绘制待测样品清除DPPH自由基的曲线。

根据曲线的线性回归方程，计算得到DPPH自由基清除率为50%时的待测样品浓度，定义为半抑制浓度（IC50），所有实验重复三次。

FRAP测定还原力
准确配置0.1mol/L醋酸缓冲液（pH=3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L 的盐酸溶液配置）和20mmol/L氯化铁溶液，并以10∶1∶1的比例混合（添加小铁钉一枚）。

3.9 mL FRAP试剂工作液加入0.1 mL的样品溶液（均已稀释至0.2 mg/mL），混合均匀后，在37 ℃恒温水浴中反应10 min，于593 nm下读取吸光值，以50 %的甲醇为空白对照。

标准曲线的绘制：吸取100 µL系列浓度为75、150、300、450、600、750、1500 µmol/LTrolox，与3.9 mLFRAP溶液混合，在37℃水浴中反应10 min，于593 nm下读取吸光值，以Trolox的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

同时结果表达为每克干重相当于Trolox还原力的相当量（mg TEAC/g DW）（Benzie & Strain, 1996）。

全血体系总抗氧化能力试剂盒（T-AOC）法
各测试样品用50 %甲醇配置成适宜浓度，按照总抗氧化能力试剂盒（T-AOC）操作说明进行测试。

以Vc作为阳性对照。

全血中总抗氧化能力(TAC)计算方法如下：
TAC (U/mL) = [(A样品-A空白) ×V0]/ [0.01×30×V1]
其中，V0=3.9 mL，V1=0.2 mL。

抑制脂质体过氧化
脂质体PBS分散体系（lecithin liposome system，LLS）制备：将300mg卵磷脂溶于30 mL PBS（10 mmol/L，pH 7.4），于超声发生器中处理数分钟得到均匀的脂质体分散液，冰浴保存备用。

三氯乙酸（TCA）-硫代巴比妥酸（TBA）-盐酸（HCl）溶液制备：15 g TCA、0.375 g TBA、2.1 mL浓盐酸，依次溶于100 mL 水中。

测定步骤：于样品管中依次加入1 mL LLS、1mL 400μmol/L FeSO4溶液和1 mL试样混匀，避光，37℃水浴60 min，再加入2 mL TCA-TBA-HCl溶液，100℃水浴15 min，迅速冷却，3 000 g离心10 min，取上清液，在波长535 nm 处测定吸光度As。

阳性对照为VC，空白管以1 mL双蒸水代替1 mL样品，操作方法同样品管，测得空白管吸光度Ac，平行测定3次，取平均值。

计算抑制率及试样抑制脂质体过氧化的IC50。

抑制率（%）＝（Ac－As）/Ac×100
清除·OH效果的测定
取0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液(10 mmol/L)于具塞试管中，加入0.2 mL的2-脱氧-D-核糖溶液(10 mmol/L)，然后再加入一定量的样品溶液，并用磷酸缓冲液(pH7.4, 0.1 mol/L)定容到1.8 mL，最后加入0.2 mL的H2O2(10 mmol/L)，混匀后于37℃保温1 h，再加入2.8%三氯乙酸1.00 mL，1.0%硫代巴比妥酸溶液1 mL，混匀后，沸水浴煮沸10 min，冷水冷却[7]。

不加DR的反应混合液不发生反应,作为比色时的空白液，测A532，计算清除率(P)。

P=[1-(As-A0)/(Ac-A0)]×100%
As:加样品液并在37℃水浴中反应的吸光值;
Ac:不加样品液,同上操作的吸光值;A0:不加样品液并且不在37℃水浴中反应的吸光值。

O-2·自由基的清除作用
取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2) 4.5mL，置于25℃水浴中预热20 min，分别加入1 mL试样和0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1 mL终止反应，299 nm处测定吸光度A，空白对照组A0以相同体积的蒸馏水代替样品。

清除率:P=[(A0-Ai)/A0]×100%。