精子冷冻技术

破坏胞内的超微结构，引起死亡
Wolley等人的研究显示，超微结构的变化是发 生在融化期间或融化之后
精液冷冻的原理（四）
三、精液冷冻的基本原理
冷冻损伤是肯定的 在两种损伤之间寻找平衡点，即最佳的降温速率 使两种损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率 实现起来非常困难 冷冻保护剂的出现是一大突破
冷冻保护剂的作用机理（一）
冷冻保护剂的作用机理（四）
四、冷冻保护剂的联合作用 1.冷冻保护剂剂量增加，其低温保护作用增强 2、冷冻保护剂的毒性作用 3、两种毒性机理不同的冷冻保护剂合用，可以达到相同的效果， 而减少毒性作用
4.渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用
冷冻的程序和方法（一）
一、冷冻过程中精子通过的温度阶段
冷冻的程序和方法（三）
3、冰晶形成阶段 精液作为一个整体从液相转变成固体相，伴随冰晶形成及由此 产生的急骤温度变化。在添加冷冻保护剂后，以5-7℃ /分的速 率通过，能获得理想的生存率 4、再结晶阶段 由于冰晶的生长和相互结合，产生温度波动，再结晶改变了细胞 内的电解质平衡，造成了进一步损伤，这种现象称为迁移性再 结冰。一般认为，这种现象一直维持至-80℃。快速通过能避 免这种损伤。
温度休克阶段 冰晶的潜热阶段 冰晶的形成阶段 再结晶阶段 室温~+5 ℃ +5 ℃ ~-5 ℃ -5 ℃ ~-15 ℃ -15 ℃ ~-80 ℃
储存阶段
-80 ℃ ~-196 ℃
冷冻的程序和方法（二）
1、温度休克阶段 温度休克：指细胞不是由于直接的冷却作用，而是由于温度急剧变 化而造成的损害。 许多种属的细胞比较明显，如牛精子在2 ℃/分的降温速率下，就 可能死亡 人类精子对温度休克有相当的抵抗力，1℃/分的降温速率比较合适 2、冰晶的潜热阶段 在通过+5 ℃ ~-5 ℃ 的温度阶段时，由于冰晶形成放出热量， 温度突升高。为了减少潜热释放、温度升高对精子的损伤，应 快速通过。
精液冷冻保存的目的
供精者的精液 生育力保存 不育症治疗 最大限度降低传染疾病的传播 优选精子
精液冷冻的原理（一）
一、冷冻精液长期储存的原理
一定的低温条件下
细胞内的分子运动速度减慢甚至停止
细胞代谢降低，处于休眠状态
一般认为-196℃ 的液氮是安全的
精液冷冻的原理（二）
二、冷冻对精子的损伤机理 1、溶质损伤效应：（慢速冷冻损伤）
冷冻的程序和方法（八）
三、精液的冻贮方式 颗粒法：设备简单，易污染，难标记 安瓿法：易标记，封口后不易污染，火焰熔封较繁琐，易爆炸 或破裂 麦管法：易标记，降温均匀，可直接授精，封口较繁琐，储存 管理不便 塑料冻存管法：易标记，易封口，易储存管理，复温偶有爆炸 注射器法：可直接授精，储存管理不便，不宜大量冻贮
温度降低至冰点 细胞外液中的水分先形成冰晶 细胞外液电解质浓度增加，渗透压增高 水分从细胞内流向细胞外，细胞发生收缩 胞外冰晶的不断形成使高渗状态和细胞收缩持续进行 过度暴露在高浓度溶质环境或过度收缩，引起损伤
精液冷冻的原理（三）
2、冰晶的机械损伤效应 ：（快速冷冻损伤）
温度降低达到细胞内冰点 未能转移至胞外的水分形成冰晶
冷冻的程序和方法（六）
2、三步法 将精液分别置于液氮水平面上两个不同的距离一定时间，然后浸入 液氮中储存。 3、多步法 利用程序降温仪来实现 4、其它ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ法 颗粒法、一步法、冰箱预冷等
冷冻的程序和方法（七）
20℃ hold 5min 1.2 ℃/min降至1 ℃ 7.2 ℃/min降至-10 ℃ 7.5 ℃/min降至-48 ℃ 32 ℃/min降至-138 ℃
一、冷冻保护剂的分类 1.根据化学结构分类：
醇类、酰胺类、高分子多糖类、单糖类、蛋白质类、 无机盐类等
2.根据作用机理分类：
（1）渗透性冷冻保护剂：丙三醇、DMSO、乙二醇等 （2）非渗透性冷冻保护剂：果糖、蔗糖 、卵黄、白蛋白等
冷冻保护剂的作用机理（二）
二、渗透性冷冻保护剂的作用机理 1、渗入细胞内，降低细胞内外渗透压的差距。当细胞外冻结时， 减轻细胞皱缩的程度和速度
精液冷冻技术
精子冷冻技术
精子冷冻的历史 精子冷冻保存的目的 精子冷冻保存的基本原理 冷冻保护剂的作用机理 冷冻的程序和方法 影响精液储存的因素
精液冷冻的历史（一）
探索 1776年，Spallanzani发现精液在自然冰雪中冷冻后复温部分精 子恢复活力 1938年，Jahnelv 发现精液储存于-79℃ 的玻璃管40天后复温 部分恢复活力 1940年，Shettles置精液于毛细玻璃管内-196℃ 储存，存活率 不超过10% 突破 1949年，Polge等发现用甘油作为冷冻精子的保护剂
精液冷冻的历史（二）
奠基 1954年后的十年中，Sherman发明了使用10%甘油作保护剂， 用-196℃ 液氮蒸气作制冷剂的方法，获得76%的冷冻生存率， 得到普遍认可 发展 在Sherman发明的方法基础上，从冷冻方法、保护剂种类等方 面的研究发展迅速 稳定 经过多年的发展，精子冷冻技术相对稳定，探索不止
2、细胞外保护剂的存在，可以降低细胞外液中溶质的浓度，减 少高浓度溶质对细胞的损坏
3、能与细胞内水分及电解质结合的特性，导致水合结构蛋白的 稳定，发挥抗冻作用 4、仅对慢速冷冻有保护作用
冷冻保护剂的作用机理（三）
三、非渗透性冷冻保护剂的作用机理 不能进入细胞，通过维持细胞膜的稳定起保护作用 冷冻时促进细胞内水分外溢，细胞发生皱缩，从而减少 了细胞内的冰晶形成 对快速冷冻和慢速冷冻都有保护作用 卵黄的作用：卵磷脂能稳定精子的细胞膜，阻止顶体膜破裂，抵 抗“温度休克”
冷冻的程序和方法（四）
5.储存阶段 虽然低于-80 ℃细胞内已无结冰现象，但经研究证实，即使在 -100℃下储存，精子生存率仍会逐步的下降，因为某些酶类还 具备一定的活性，使细胞进行简单、缓慢的代谢。一般认为， 在-196 ℃液氮中保存是安全的。
冷冻的程序和方法（五）
二、冷冻的程序和方法 根据精子冷冻时需要通过的温度阶段，冷冻程序设计的原理基本相 同，但在实现的方法上却有很多种，主要有以下几种： 1、二步法 将精液置于液氮水平面上一个固定距离一定时间，然后浸入液氮中 储存。