胚胎工程

三种保存方法
常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的 代谢活动，一般可以保存2天以上。 低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除 猪外，其它家畜的保存效果均较好。 如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液 ，用时可以即时解冻。 对于不同的动物，各种保存液的配制方法都 有所差异的。
人为使得精子获能
可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性 生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种 属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物 的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需 动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制 的培养液使得精子获能
镜检卵母细胞
如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡 士林石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角 ，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞， 滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并 轻压之，即可置于相差显微镜下观察。 如果要观察细节，需要染色、切片后观察。 一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进 行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固， 进行观察。
第七章 胚胎工程
发育工程） 胚胎工程 （发育工程）
胚胎工程（embryo engineering）是指所有对配子 和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式 或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。 在研究过程中发现，低等动物的生存和发育环境相 对比高等动物简单，材料易得，容易操作，因此研 究成果较多。但由于哺乳动物的胚胎工程意义较低 等动物大，因此本章将要介绍有关哺乳动物胚胎工 程中的配子操作（gamete manipulation）和胚胎操 作（embryo manipulation）。
采卵
3. 对于屠宰场中的大中型动物，可以用注 射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢 ，以注射器自卵泡中取卵。 4. 对人而言通常在超数排卵步骤处理后， 用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后， 在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望 远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情 况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将 卵吸出，放平皿中检查。
6)多精受精的阻止
1）透明带反应，在皮层反应后，由于皮层 颗粒内物质释放到透明带表面，卵质膜发生 了重组，破坏了精子受体，其它精子不能再 与透明带结合。 2）皮质反应后产生受精膜。
7）原核变化及融合
精子进入卵内后，精子核膨大，核膜由于泡状化而破裂，并分 散在卵细胞质中，其中的染色质也由致密状态开始松散而成为 颗粒或细丝状，逐渐形成雄原核。 卵子细胞核在完成两次减数分裂后，染色体首先分散，沿着分 散的染色体的边缘汇集了一些小囊，逐渐融合形成一双层包膜 ，从而形成了一些内含染色体的小囊，即染色体泡。然后，它 们相互接近，包膜彼此合并成为一个不规则的雌原核。 雌、雄原核移向卵的中央，相遇，核膜消失，染色体彼此混杂 在一起，从而使配子的单倍体恢复成为合子的双倍体。受精完 成。
卵母细胞
人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激 素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性 腺激素或黄体激素释放激素（LH－RH）， 对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与 诱发其排卵，排卵数目不变。 以小鼠为例，通常可用3－5IU PMSG或2－ 3IU hCG或100µg FSH 或100µgLH或0.02－ 0.05µg LH－RH皮下或腹腔内注射，12－14 小时可以有70％－100％正常排卵。
人受精和胚胎发育全过程
7.13动物早期胚胎发育及其分子机制 7.13动物早期胚胎发育及其分子机制
精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精 卵经过卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进 入原肠胚阶段，形成不同胚层，再产生器官 原基，进一步产生个体。
早期胚胎 发育
卵裂：合子发生 分裂形成无数小 细胞。卵裂细胞 不生长而连续分 裂。主要是卵裂 球的有丝分裂器 与表层胞质变化 的过程。 桑椹胚：卵裂数 次后，出现实心 细胞团，形似桑 椹ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ名
7.2配子操作 7.2配子操作
7.21精子 7.22卵母细胞 7.23体外受精
7.21精子 7.21精子
精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺 激法、阴道内回收法等。 对于个体较大的动 物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多 采用电刺激法采精。
人工阴道法
人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层 之间充以温水（38℃－40℃），后端有精液 收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于 公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴 道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。在公 猪可以用猪用假阴道收集精液或用手握法采 精，但仍需要台畜，使其爬上以遍进行操作 。 另外，也可以用特制的电极，插到公畜的 直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激 ，经过不同的时间，即可射精而得到精液。
胚胎发育
胚泡：哺乳动物的胚胎处 于16细胞期的桑椹期时， 胚胎是球型细胞团，细胞 之间形成充满液体的腔隙 ，然后它们联合形成一个 大腔位于胚胎的一端，即 为胚泡结构。 囊胚：桑椹胚随着卵裂出 现充满液体的囊胚腔，围 绕囊胚腔的细胞组成囊胚 层 原肠胚：囊胚继续发育、 分化，形成双胚层或三胚 层的原肠胚。外层为外胚 层、迁到里面的称为内胚 层和中胚层。
精液的保存
精液的保存可以分为常温（15－25℃）、低 温（0－5℃）和超低温冷冻（－79℃－196℃）三种，其目的是要降低精子的代谢 活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能 力。 保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分 为稀释剂、营养剂和保护剂等。 稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液， 营养剂包括糖类、奶类和卵黄等， 保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些 如甘油、DMSO、糖类等。
7.1受精于胚胎发育 7.1受精于胚胎发育
7.11精卵发生 7.12受精 7.13动物早期胚胎 发育及其分子机制
7.21精卵发生和受精 7.21精卵发生和受精
哺乳动物的生殖是一个相当复杂的生命现象， 在胚胎早期，生殖细胞首先与体细胞分离，形 成的细胞为原生殖细胞(PGCs),其后，经过性 别决定和将要进行的性别分化，形成两种生殖 细胞。 生殖细胞经过增殖期、生长期和成熟期,最终形 成精子和卵子。
形态变化中的分子机制
形态变化的基础是细胞分化，而细胞分化又 是由该细胞所接受的位置信息所决定的。位 置信息是以位置值的形成赋予细胞的。 细胞根据所获得的位置值和自身其基因组所 处的状态来表达适当的基因，其结果表现为 细胞分化，同时伴随着某些新蛋白的合成。 同源异型基因:对躯体进行规划的调控基因， 如果发生突变就可以使身体中的某个完整的 体节或体节上某个完整的结构发生变化
采卵
输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可 将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆 盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大不，用磨尖 的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出 而找到卵。 对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例 如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵 管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处 插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输 卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细 管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得 到冲出的卵。
哺乳动物 胚泡着床
•内细胞团：在胚泡 胚极一端，能够发 育成为胚胎主体的 一团细胞 滋养层细胞：外 层发育成为胎盘的 细胞。 着床：胚泡和子宫 壁相互接触并侵入 子宫组织的过程。
细胞质定域
细胞质的分布及其在子细胞中的分配并不是 均匀的，有的物质在胞质中有一定的区域。 在一定程度上决定着细胞的早期分化，这种 特殊物质在受精卵中的特殊定位，以及卵裂 时对各子细胞分配的不均匀性，即细胞质定 域。 生殖细胞具有特殊的卵子细胞质，即生殖质 ，是生殖细胞的决定因素，它在卵子中位于 一定部位，在卵裂中分离，进入生殖细胞
早期发育的基因表达
胚胎发育初期是受母体基因组影响，依靠卵 原性基因合成各种蛋白质，而由父、母本结 合形成的胚胎基因组影响甚微。但继续发育 ，由于卵原性基因消耗殆尽，影响减弱，合 子基因组则显出突出作用，不同动物合子基 因组参与调控的开始时间也不同。 哺乳动物卵裂是受卵原性转录本和合子基因 组新转录本的共同调节。
卵子的发生
一个卵巢包含三个世代的卵母细胞，每当一个世代 的卵母细胞成熟后，就被新的世代所取代。 在哺乳类，所有卵原细胞成熟后和卵原细胞转变为 卵母细胞是在胎儿分娩前完成。 卵母细胞形成阶段是从胎儿诞生开始一直到性成熟 排卵为止。 直到青春期卵母细胞才进行生长，以后每个性周期 后有一批新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞 在每个周期发育中未成熟就退化。 卵母细胞的成熟过程受MPF(成熟促进因子）和CSF （细胞生长抑制因子）的相互调节。
超数排卵
如果一次要获得多个卵，可以利用促性腺激素处 理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被 排出，这个过程就称为超数排卵（ superovulation） 如在小鼠Ⅳ－Ⅴ期涂片相时注射5－10IU PMSG ，48－50小时后，再于皮下或腹腔注射5－10 IU hCG，这种方法可以获得超数排卵。 人的人工采卵和超数排卵，要在月经期5－9天， 每天给予100－150mg 克罗米酚，11天或12天用 B型超声检测卵巢表面的卵泡直径达到20mm时， 再给予4000－9000 IU hCG，32－40小时后取卵 。
精子的结构
头部：顶体、细胞核 尾部：颈、中段、主 段和末端。 顶体内部含有水解酶 ，能协助精子穿入卵 周围的卵膜。 精子质膜外表面存在 有多种凝集素受体。 鞭毛为9＋2微管结构
精子的发生
卵子的结构
卵细胞内部物种空间结构排列具有极性，卵 内组分沿着卵的主轴分布不均匀，形成动物 级和植物级。卵黄积聚在植物级。 卵细胞分布在两个固定的区域，质膜下细胞 质称为皮层，皮层是高度粘滞、半硬的凝胶 状，内含有皮层颗粒和色素颗粒。大部分卵 细胞质——内质是液体状态，内含线粒体和 生殖质。 卵细胞排出卵巢后，有卵膜包被
卵巢激素控制示意图
7.12受精作用
1）精子的成熟和获能
精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必 须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内获能 ，才具有使卵受精的能力。 在附睾液和精液中存在着附睾蛋白和精清蛋 白，称为去获能因子，精液中的精子表面被 覆了这种因子。在雌性生殖道中的分泌物可 以去掉这些覆盖物而使精子质膜、顶体发生 一系列变化
2）精子的行进
在正常生殖过程中，精子在阴道和子宫内的 运动速度很快，十几分钟即达到输卵管，积 聚在输卵管峡部下2－3cm处，在此停留十几 到几十个小时，然后继续上行，只有少数精 子可以达到卵管壶峡连接部，在此与刚排出 的卵相遇，完成受精过程
3）顶体反应
定义：精子在同卵子表面 接触或与卵膜分泌的物质 相遇后，精子的顶体就会 发生一系列的变化。精子 顶体帽部分的质膜和顶体 外膜在卵的透明带卵丘及 输卵管分泌物的作用下， 在多处发生融合，因此在 该部出现很多裂口，使得 顶体内部的物质释放出来 ，包括各种水解酶，从而 使它们在受精中起作用
4）精卵融合过程
A 顶体反应后，精子 穿过透明带进入卵周 隙 B 以赤道段与卵质膜 相融合 C 融合后CGs胞吐 ，核开始去致密 D 精子头部完全入 卵，将一部分卵质膜 带入。
5）卵子的激活
精子一旦与卵子接触，卵子本身就开始发生一系列 深刻的变化，即卵子的激活。 卵子激活时，皮层颗粒首先于接触点发生破裂，然 后波及整个卵子的皮层，发生皮层反应。皮层颗粒 内含物被排出，一部分与卵外的卵黄膜一起形成受 精膜，防止多精受精。另一部分留在卵子和受精膜 间的卵周隙中，吸收水分，结果使受精膜逐渐与卵 子分开而举起。另外，皮层颗粒排放出的粘多糖形 成一种粘性的透明膜物质，与卵表面紧密相粘，作 用是保持随后的分裂球聚集在一起。
卵母细胞一般检测 得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在 显微镜下检查核和胞质发育的状况，如核的形态、 位置和所处的时期。 排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞包围，除去卵丘 细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核 处于第二次成熟分裂中期。 多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状，但由于胞 质中富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈暗色。 各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类 可以分为优秀、普通、不良和异常卵。 进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复 合体外面完整地包有3－4层卵丘细胞，卵母细胞胞 质无斑块者为佳。