絮凝剂

关于节杆菌属产生物絮凝剂的研究
摘要：用于研究的可产生物絮凝剂的细菌是从南非开普省东部的一条河流中分离得到的，通过鉴定，它的16S rRNA基因核苷酸序列和节杆菌属的有91%的相似度，和节杆菌属一样，这个核苷酸序列都储存在基因库中。

当在有氧的环境下生长成一种产品中间物时，细菌产生了一种胞外生物絮凝剂，产品中间包含葡萄糖，葡萄糖作为唯一的碳源，并且初始PH为7.0。

我们调查研究了碳源，氮源，金属离子源以及初始PH对絮凝活性的影响。

当乳糖和尿素分别作为唯一的碳源和氮源来源时，这类细菌能产最佳生物絮凝剂，此时絮凝活性分别为75.4%，83.4%。

另外，当中间物的初始PH值为7.0时，这类细菌也能产最佳的生物絮凝剂，此时絮凝活性为84%；当Mg2+作为阳离子来源时，絮凝活性为77%。

构成分析表明这种生物絮凝剂主要是一类由大约56%的蛋白质和25%的总碳水化合物组成的糖蛋白。

关键词：节杆菌属淡水生物絮凝剂
1介绍
目前，有机和无机絮凝剂都被广泛地用于多孔胶体材料的沉降，因此被应用在很多的工业领域中，比如纯净水的净化，废水处理，食品工业，清淤疏浚，发酵进程。

尽管它们对人类和环境有害，各种各样的化学合成的絮凝剂（例如铝盐，聚丙烯酰胺衍生品）常常被用于
这些过程中，因为这种方法合成的絮凝剂，成本低，效率高。

为了避免无机和合成的絮凝剂给环境和健康带来的问题，在最近几年，由微生物产生的絮凝剂已经吸引了大量的科学与技术的关注，生物絮凝剂的工业潜力长期以来已经被公认，因为它们的无害化，生物降解能力，降解的中间产物无次级污染。

大多数由不同微生物产生的生物絮凝剂通常是高分子聚合物，比如多糖，蛋白质，糖蛋白，核酸。

尽管许多微生物已经通过产生物絮凝剂能力的筛选，但到目前为止，很少的一部分已经实现大规模的商业生产。

高成本，低产量似乎已经成为了发展科学和商业应用的生物絮凝剂研究进程的主要阻碍因素。

然而，为了减少成本和优化培菌条件，像批量生产的策略已经被采用。

目前的关于淡水细菌产生物絮凝剂潜力的研究报告是作为我们对新颖的生物絮凝剂（作为与无机和合成絮凝剂竞选的备选方案）研究的一部分。

节杆菌属是一类普通的土壤菌菌属，这类菌属的所有种类普遍地没有产孢子的能力。

因为其新陈代谢的多样性，节杆菌属物种已经被用于修复被污染的水的工业应用中。

节杆菌属对富含硝酸盐的工业垃圾的生物修复的有效性已经被证明。

2结果和讨论
2.1.细菌身份的鉴定
被测试的细菌是从南非开普省东部的Tyume河流中分离得到的，这些细菌已经经过筛选，具有产生物絮凝剂的潜力。

初始的筛选显示
在PH为7.0时，细菌有能力絮凝悬浮的高岭土（4g/L），对细菌的16S rRNA基因进行聚合酶链反应扩增，得到了预期大小（大约1.5kb）的扩增子。

16S rRNA基因核苷酸序列分析显示被测试的细菌和节杆菌属由91%的相似度，核苷酸系列都被存储在基因库中，就像节杆菌属的登记号为HQ875723。

图1.节杆菌属的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳Lanes: 1 = 梯道; 2 = PCR产物
2.2 培养条件对生物絮凝作用的影响
这些影响例如：生产的中间产物和培养条件对生物絮凝剂都有影响。

通过试验菌在不同条件下（如：碳源，氮源，离子和PH等因子）
对生物絮凝剂的活性从而评估其条件对生物絮凝作用的影响。

乳糖、蔗糖、果糖和淀粉对生物絮凝度影响的评定结果见表一。

乳糖和蔗糖在碳源中是良好的碳源，使生物絮凝剂的活性分别大道７５％和７３.４％；而果糖和淀粉就不能促进生物絮凝剂的活性（见表一）。

对于蔗糖作为碳源的评定，其结果可以从Ｌｉｅｔａｌ［３］的“由地衣芽孢桿菌Ｘ１４絮凝剂的生产”的研究报告中可以看到。

然而，与目前研究相反的是淀粉被发现可以提高地衣芽孢桿菌Ｘ１４的絮凝剂生产，而不是乳糖。

Patil et al. [14] 和He et al. [15]研究指出，在固氮菌和取盐单胞菌中各自的絮凝化作用中，用蔗糖作为碳源都具有良好的絮凝剂回收率。

Bacillus sp. Gilbert [16]和Virgibacillus sp. Rob [17]的报告中，淀粉也被指出作为少量的碳源用于絮凝化作用。

Rob [17]也指出果糖在在生物絮凝剂的生产中不是良好的碳源。

氮源在生物絮凝剂的生产中被调查出与培养品系在同一种介质中，除吃之外，氮源是各式各样的（见表一）。

节杆菌可以地利用有机物（如尿素）和无机物（如硫酸铵）作为氮源，利用尿素有效地作用，使絮凝剂的活性达到83.4%，其次是硫酸铵的79%和氯化铵的61%（见表一）。

Patil et al. [14]通过固氮菌测验氮源对生物絮凝剂生产的影响，研究表明除了酵母提取物外，尿素和硫酸铵都能有效的促进生物絮凝作用。

另一方面，Halomonas sp. V3a’和AAD6[15,19]分别都证实了氯化铵作为氮源能有效的促进生物絮凝剂的生产。

不过，与当前研究节杆菌相反的是，酵母膏和蛋白胨在带白节杆菌LC13T [12].的实验中被发现是最佳的氮源促进生物絮凝剂的生产。

许多菌株
的实验中已经证明了当前的有机氮源是最佳促进生产生物絮凝剂（有时候是有机氮源和无机氮源相结合）
表一：以节杆菌为例培养成份对生物絮凝化活动的影响
备注：“-”表示没有絮凝化活动发现
所用的培养基[1]中的阳离子絮凝剂生产的影响。

各种阳离子对絮凝活性的影响进行评估，使用氯化铁，氯化镁的方案，以FeSO4·7H2O和KCl作为阳离子的来源。

表1中，二价阳离子此外可以看出，以Mg2 +作为强化絮凝时，相比絮凝效果最高，单价阳离子K +次之。

两个Fe3 +和Fe2 +的无絮凝效果。

另据报道，为增加在絮凝剂virgibacillus SP中Mg2 +含量。

罗布[17]。

相比之下，为絮凝剂LC13-SF制作的节杆菌albidusLC13T，最大絮凝效率所需的Ca2 +的存在[12]有类似的效果。

另据报道，由絮凝剂生产Vagococcus SP的最佳絮凝剂 W31和盐单胞菌藻。

V3A“[22,23]。

对
于沙雷ficaria生产絮凝剂，除了两个二价阳离子Ca2 +和Mg2 +的絮凝活性增强，而共同存在的三价阳离子Al3 +和Fe3 +产生负面影响絮凝活性[20]。

李等人。

[24]报道的要求提高絮凝效率的单价和二价阳离子的共同存在气单胞菌。

实现絮凝活性高，经常使用添加阳离子来中和带负电荷。

2012年，131058从而削弱的静电排斥力，从而提高絮凝效果[2]。

这些阳离子对絮凝剂生产微生物的絮凝率的影响各不相同。

溶液的pH值也是影响絮凝效果的关键因素，从而有效地影响絮凝过程[26]。

本实验为研究絮凝节杆菌活性介质的初始pH值的影响对 raats进行了调查，在pH值从3到11不等时，絮凝活性被发现是在中性pH条件（pH值7.0）明显较高（84％）比在酸性和碱性条件下（图2）高。

类似的pH值（pH值7.2和7.0）的报告，莫拉菌盐单胞菌产生的微生物絮凝剂ERß-31的最佳活动PH也在期间。

絮凝剂HBF-3，由一个突变的盐单胞菌产生。

V3A在pH 7时也取得了最高的絮凝活性，[23]。

在低pH值，H +离子的吸收趋于削弱的絮凝剂高岭土复杂的形成过程，在高pH值也观察到类似的效果。

据李等人 [25]，在中性pH值在阳离子存在时絮凝效果似乎是最强的。

然而，这些意见是从Choi等人进行的研究不同。

其中最大的鱼腥藻产生的微生物絮凝剂絮凝现象。

在pH值2分别培养芽孢杆
菌 F19和鱼腥藻，芽孢杆菌产生的絮凝剂。

PY-90被发现最适酸性pH值范围在3.0至5.0 [29]，而沙雷ficaria生产最适弱酸性pH值范围为5.0到7.0 [20]。

初始PH对絮凝效果的影响
20
40
60
80
100
0510
15
初始PH
絮凝效果%系列1
2.3 。

絮凝剂生产时间课程含量
图3显示了节杆菌生产絮凝剂的时间过程。

raats 在光密度，pH 值和絮凝活性超过10天的培育期。

在生长过程中，在第5天达到最高的87.5％絮凝活性被观察到的增加迅速下降之外，注意到增长在过去4天完全丧失了活性（图3）。

在细胞的生长的后期阶段，观察絮凝活性下降，可能是由于抗絮凝酶的活性。

据Jang 等人的研究，通过补料生产分批培养的方式生产絮凝剂，絮凝活性和生物絮凝剂生产被发酵条件影响，其中包括碳源，接种量，溶氧张力（DOT ）的碳/氮（的C / N ）源的比例。

Jang 等还指出，初始增长率随着碳源浓度的增加而增加。

然而，碳源的消耗严重限制碳源浓度较高。

接种量影响的不仅是细胞的生长，而且影响产品的形成与柠檬酸SP 细胞的动态行为。

接种絮凝剂活性的影响在不同大小的细胞培养。

这个合成
絮凝剂的絮凝活性也显示着：生长介质的C / N比率较高的C / N比率不一定转化絮凝剂的合成产量较高[30]。

通过发酵培养基的初始pH 值，可以判断细胞的电荷和氧化还原电位，反过来又可以影响营养吸收和酶促反应[12]。

因此，在细胞生长中的絮凝活性观察第5天的生长期（OD600值）相应的稳步增长是可能是一个迹象，絮凝剂由合成细菌的生长过程中产生的，而不是由细胞自溶[22]。

从72至120小时，pH值稳步上升，直到在pH值7.0达到最佳的絮凝活性。

经过6天的培养，观察的絮凝活性的完全丧失，而pH值急剧上升，并保持周围pH值8.2（图3）。

不同生物絮凝剂生产和培养时间之间的关系可能会有所不同。

在发酵时间为72小时，中性条件下（pH值7.0），获得最大的生产水平和节杆菌albidus LC13T产生的生物絮凝剂絮凝高峰的90.6％[12]。

在稳定期为获得芽孢杆菌licheniforms，生产絮凝剂和细胞生长最大值[32]。

李[3]和夏等人[21]表明，芽孢杆菌licheniforms X14和奇异变形杆菌TJ-1，实现在更短的时间比其他菌株（24小时）的要求，最大的絮凝剂生产，而絮凝活性在稳定期（48小时）达到高峰。

在细菌生长的培养基pH值观测到的波动，也可以归因根据到Lors等。

[33]，两种相反的现象：细菌活动的pH 值下降，释放的相关浸出阳离子的氢氧根离子的pH值的增加。

两者合计，这些意见似乎强烈支持美联储分批培养方法，以充分了解参与越来越多的细胞培养的动态。

生长动力学和底物浓度之间的关系是研究的基本，特别是为单一底物日益增长的纯培养中存在的巨大不一致。

进一步混淆的问题是事实，微生物倾向于改变其动力学性能，以
适应不断变化的环境
2.4。

絮凝剂化学成分的分析
纯化的絮凝剂（1毫克/毫升）的化学分析，发现含有0.25毫克/毫升总碳水化合物和0.56毫克/毫升的蛋白质分别，从而确认该絮凝剂主要是一种糖蛋白。

Inoue等。

[35]研究了节杆菌产生的生物大分子。

并透露这是一个异质多糖，这主要是一个半乳聚糖硫酸。

已报告的其他生物体产生不同种类的糖蛋白微生物絮凝剂[5,36]。

3。

试验段
3.1。

检验菌和培养条件。

检验细菌来自Tyume河隔离细菌在南非东开普省，南非黑尔堡，爱丽丝环境微生物学研究组（AEMREG）收藏，。

被保存的细菌琼脂斜面和甘油（20％库存在-80°C栽培，培养介质的组成如下：糖（10克），硫酸镁混合准备•7H2O（0.3克），磷酸氢二钾（5克），蛋白胨（1.0克）和磷酸二氢钾（0.2Ğ升去离子水）在pH 7.0。

一个测试细菌菌落接种到5毫升的培养基中，摇床转速（160转）在28°C 孵育5天。

离心培养基（2毫升）（8000×克，15分钟）和无细胞上清液絮凝活性的测定。

3.2。

根据仓根等为试验材料
使用的高岭土悬浮液絮凝活性絮凝活性的测定。

作为库存随后的检
测解决方案使用的高岭土（4克/ L）悬浮在去离子水，pH值7。

在试管中混合以下解决方案：高岭土悬浮液（10毫升），培养上清（0.1毫升）和1％的氯化钙（0.25毫升）。

也包括在其中培养上清液，用去离子水代替控制和类似条件下的测量。

所有混合物的最终体积至10 mL去离子水。

混合解决方案是允许5分钟解决。

在室温下。

1 ThermoSpectronic分光光度计（赫利俄斯EPSILON，美国）和絮凝活性如下决定使用550纳米：澄清的上层相溶液的光密度（OD值）是衡量絮凝活性= [（乙- 一）/ B]×100％其中A和B样品在550 nm 的光密度分别控制。

3.3。

絮凝剂生产的碳和氮的来源
对以下碳源的影响进行了评估：乳糖，蔗糖，果糖和淀粉。

氮源候选人包括硫酸铵，氯化铵和尿素。

评估完成按照由Lachhwani所描述的方法[38]。

3.4。

金属离子的影响，
各种离子和pH值对生物絮凝剂生产的影响进行了评估利用上述阐述的过程，但被替换了不同的盐溶液和氯化钙溶液絮凝活性确定。

氯化钾，氯化镁，氯化铁和硫酸亚铁解决方案•7H2O作为阳离子的来源。

评估的pH值对絮凝活性的影响，高岭土悬浮液的初始pH值pH值范围在3-11之间变化与盐酸或氢氧化钠调整[39]。

3.5。

絮凝剂生产时间
课程含量款描述的方法制备絮凝剂生产培养基的组成。

选定的菌株是在50毫升的中型载于50 ml烧瓶旋转摇床（160转）在28°C下16小时分批发酵种子培养用于预培养。

根据高等改性方法进行了分批发酵。

[22]。

种子文化（10％V / V）接种500毫升瓶150毫升的中型摇床转速（160转），在28°C一段时间240小时，并在适当的时间间隔（24小时）为培养标本被撤回增长（OD660），pH值和絮凝活性的监测。

培养液（5毫升），离心（8000×克，15分钟）和无细胞上清液被用来确定絮凝活性，如前面所述。

3.6。

生物絮凝剂的提取，纯化及表征
经过5天的发酵，然后进行微生物絮凝剂的提取，纯化和表征，培养液离心（8000×克，15分钟），以去除细菌细胞。

添加到上清相和离心（8000×克，15分钟）。

一个体积的蒸馏水，除去不溶性物质。

取上清，然后用2倍体积的乙醇混合，搅拌，并在4°Ç静置12小时在。

倒出上清和沉淀物真空干燥获得原油的生物高分子粗品，然后溶解在蒸馏水和1体积的氯仿/正丁醇（5:2，V）混合。

搅拌后，将混合物在室温下静置12小时。

上层相分离，离心（3000×克，15分钟）和上清集中在40°C。

两个乙醇量增加，收回的沉淀，真空干燥和重新溶解在蒸馏水。

此后，蛋白质含量，使用福林Lowry法测定，总糖的测定采用苯酚- 硫酸由Lachhwani描述[38]。

3.7。

微生物絮凝剂产生菌的鉴定
通过2-3个复制，即在70μL无菌双蒸水悬浮煮沸法进行了鉴定的絮凝剂产生菌的DNA提取：DNA提取。

样品在100°C加热10分钟，让其冷却5分钟后，在5分钟3000转离心，水浴。

上清液转移到一个干净的试管，并储存在4°C作为PCR检测模板。

进行PCR扩增PCR扩增：在50μl反应体系包含2毫米氯化镁，2个U Supertherm Taq聚合酶，每个核苷酸150毫米，0.5毫米（F1每个引物的量：在59 AGAGTTTGATCITGGCTCAG-39;我= R5的肌苷和引物： 59 ACGGITACCTTGTTAC GACTT-39）和2μLDNA模板。

引物F1和R5结合基地的位置，分别为7-26和（1496年至1476年的）16S rRNA 基因霉菌ambofaciens ATCC 23877 [40]。

在这项研究中的引物，用于扩增16S rDNA序列。

使用的PCR程序为初始变性（96℃）2分钟，30个循环（96℃45秒）的变性，退火（56°C的第30号）和扩展（72℃2分钟），并最终延伸（72℃5分钟）。

凝胶电泳PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认已正确大小的片段扩增。

用24毛细血管Spectrumedix SCE2410遗传分析系统，自动化的细菌菌株鉴定16S rRNA的基因序列。

根据说明书的指示进行测序反应，使用大染料3.1染料终止循环测序试剂盒（Applied Biosystems公司）和27F底漆。

序列最相似序列的基础上，进行手动编辑。

结论
节杆菌产生的絮凝剂。

raats表现出良好的高岭土悬浮液絮凝活性。

乳糖和尿素为唯一碳源和氮源由细菌生产絮凝剂的首选。

二价阳离子（Mg2 +）的以及初始培养基pH值7.0絮凝剂的最佳生产，和化学分析表明，絮凝剂是一种糖蛋白，约56％的蛋白质和25％的糖组成。

节杆菌raats，作为一个新的絮凝剂，能站在作为替代无机和有机合成絮凝剂的来源。

我们感谢支持这项研究的大学，南非黑尔堡，爱丽丝和南非国家研究基金会
图3。

节杆菌絮凝剂生产过程中的时间分析。

PH 絮凝活性（%）光密度（600nm）
时间（h）。