重组人干扰素生产工艺

3.4．菌体收集 ．
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥 失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
4 干扰素的分离纯化工艺过程
4.1、干扰素分离工艺过程
4.2、干扰素的纯化工艺过程
4.1 干扰素 干扰素α-2b分离工艺过程 分离工艺过程
体外诱生干扰素制备工艺： 体外诱生干扰素制备工艺 Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 1g IFNα 3 ml 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性
干扰素生产工艺路线（ ） 干扰素生产工艺路线（2）
干扰素生产工艺路线（5） 干扰素生产工艺路线（ ）
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
•宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） •上市产品：IFN α-2b/安福隆 • •表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性 •工艺特点： 发酵周期短：几个小时 无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析
II 型干扰素：干扰素 （IFNγ) 型干扰素：干扰素γ（ γ 来源：活化的T细胞和 细胞产生 来源：活化的 细胞和NK细胞产生 细胞和 功能： 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和 细胞和NK细胞的杀伤活性 增强 细胞和 细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 细胞形成， 抑制 细胞形成 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN）， ），小鼠干扰素 MuIFN）。 （MuIFN
免疫调节活性机制
免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细 胞等均有一定作用。 对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递 呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗 体包被的病原体和肿瘤细胞。 对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影 响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入 会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生 免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用， 但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的 增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制 IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。 对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬 能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞 （如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递 呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉， 吸引循环的淋巴细胞。
第十五章 重组人干扰素生产工艺
2010.4.12
主要内容
干扰素概述 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 干扰素的发酵工艺过程 干扰素的分离纯化工艺过程
1 .干扰素概述 干扰素概述
干扰素的种类 干扰素的理化性质 干扰素的生物学活性 干扰素的临床应用 干扰素的生产工艺路线
1.1 干扰素的种类
概念： （interferon，IFN）
第二步：表达载体构建
• IFN基因与表达载体连接
• 转化大肠杆菌 • 筛选阳性克隆 • 获得序列正确表达载体
第三步： 第三步：工程菌构建
转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
2.2基因工程菌的特性 基因工程菌的特性
（1）具有宿主菌的特征： 细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状,粘稠。 生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为 （2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR （3）具有生产干扰素能力： 放射性免疫学效价不低于2.0×109 IU/L。
菌体裂解 预处理 初级分离
பைடு நூலகம் (1)菌体裂解 菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃ （pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理 沉淀 预处理-沉淀 预处理
加絮凝剂聚乙烯亚胺:
人源转化细胞系培养生产工艺： 人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。
干扰素生产工艺路线（ ） 干扰素生产工艺路线（3）
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺: 上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液:
2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。
(3)离心 离心
连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
（4）初级分离 ）
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获得 国家一类新药证书。 研发中的重组干扰素：IFN ω，临床阶段
1.2干扰素的理化性质 干扰素的理化性质
143-166aa； MW:18-40 ku； pI: 6.5-7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纤维膜、琼脂和塑料等介质。
1.4 重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角 膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍 奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤 （rhuIFNγ） 多发性硬化症 rhuIFNβ
1.5.干扰素生产工艺路线（1） 干扰素生产工艺路线（ ） 干扰素生产工艺路线
病毒复制
抑制病 毒复制 IFN-诱导蛋白 诱导蛋白
诱导刺激 胞核
信号转导 胞核
IFN-α α
抗肿瘤作用机制
Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞 型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞 的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择 性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强 500～1000倍。另外，Ⅱ 500～1000倍。另外，Ⅱ型干扰素也可通过增 强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其 抗肿瘤效应。
天然干扰素分类
1. 根据来源、 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 型干扰素： 来源：白细胞、成纤维细胞、 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 抗病毒感染、 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱 较弱） 免疫调节 较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
2.3 菌种库的建立与保藏
• QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 • 菌种检查合格后，方可投产。
3 .干扰素α-2b的发酵工艺过程
3.1摇瓶培养 摇瓶培养
取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。
3.2 种子罐培养
2. 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
基因工程假单胞杆菌菌种建立 基因工程假单胞杆菌菌种特性 菌种库的建立与保藏
2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立 、
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建
第一步：干扰素基因的克隆 第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
4.2、干扰素纯化工艺过程 、
溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装
(1) 溶解粗干扰素
配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 µm滤器和 10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2℃～10℃。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解： 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
1.3干扰素的生物学活性 干扰素的生物学活性
正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作 用下才能诱使细胞产生干扰素。
1.3.1广谱抗病毒活性机制 广谱抗病毒活性机制
Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病 毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作 用引起的。 ①对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白” 基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒 mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。 ②干扰素能提高细胞表面MHCⅠ类分子的表达水平，受到病毒感染的细 胞表面MHCⅠ类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞 的溶解。 ③干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。
接种：接入50L种子罐，接种量10%。 培养：30℃，pH7.0。 控制：级联调节通气量和搅拌转速
DO为30%，3～4h，OD>4.0。
检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂 菌。
3.3 发酵罐培养
接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。 前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。 4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。 终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至 15℃以下。 检测：发酵液杂菌检查
干扰素生产工艺路线（ ） 干扰素生产工艺路线（4）
动物无限细胞系培养生产工艺： 动物无限细胞系培养生产工艺：
上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程 严格
干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞 通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近 的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon，简称IFN。 发现：干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭 活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了 一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰 其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。 以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括 病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感 染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗 病毒感染的防御系统。
(2) 沉淀与疏水层析
等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂 蛋白，离心收集上清液。 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白
洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。
等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导 值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku 超滤膜，0.005 M缓冲液。