烟草细胞

酶活测定结果
分析
• 上图显示，尽管fLUC和rLUC的酶活数目不同 ，但是有相同的趋势，他们的关联系数R =0.932。HEAT map 显示相同的样品之间 fLUC酶活性就存在很大的差异。他们之间的 平均标准误为6.9%，但是根据统计学关联 差异度，如果以rLUC的酶活数目为内部调控 做标准化，这种标准误就降低到了2.6%。
何为瞬时表达(Transient expression)
• 瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进 受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物 。
• 是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位 及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因 相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具 有简单、快速、周期短、准确等优点 。瞬时表达 不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效 率较稳定，转化率高。同时，瞬时表达不产生可 遗传的子代，生物安全性高。
烟草细胞中茉莉酸信号通路自 动化和标准化的瞬时表达分析
探究
汇报人：***
综述
一、基因研究现状
尽管基因序列信息和基因组分析已近 大大提升了人们的研究空间，但是对 大多说基因的具体功能仍不是很清楚。 即使是在模式作物中，至少有三分之 一的基因功能是未知的。大多数基因 是依靠序列同源性和转录物类型进行 分类的，并且最多有十分之一的基因 是通过分子生物学和遗传学进行更深 的研究。基因功能研究受到挑战。
质粒DNA的用量标准验证
• 因为质粒DNA的总量是瞬时表达实验的一个 限制因子。设计了带有35Spro::rLUC::35Ster 的最小质粒，转染拟南芥和烟草BY-2.来测 定0.5–10 μg之间，rLUC的活性。BY-2显示的 是一个对数关系曲线(R2=0.9943; n=8)，拟南 芥显示的是一个指数关系(R2 =0.9941; n =4) 。根据瞬时表达的要求原生质体数目为104 到105 原生质体数，选择了BY-2的使用量为 1μg。
本文要点ຫໍສະໝຸດ Baidu
• 实验用的载体选择方法 • 原生质体PEG自动化转染 • 双荧光素酶转录读出标准化分析 • 原生质体转化效率分析 • 尼古丁生物合成途径中潜在调控因子筛选 • NtORC1 和NtJAP1 转入BY-2 影响分析
设计自动化瞬时表达系统
• 根据已发表的瞬时表达步骤()，设计了自动化的瞬 时表达操作系统。该系统在TECAN Genesis 200机 械化平台上进行 操作。（为本文章所独创的）。 该系统的好处如下：
图示（R平方为相似度）
烟草茉莉酸信号途径研究
• 技术路线
一、茉莉酸处理结果分析 二、 发生改变的基因分类 三、确定基因研究参考指标 四、实验验证参考指标 五、筛选可能的诱导基因 六、过表达研究获得的基因
何为BY-2细胞
• 烟草BY2细胞(Nicotiana tabacum L．ev Bright Yellow • 2。BY2)是一个非常重要且用途广泛的细胞系。它由Kato • 等于1972分离得到．在现有已建立的成熟植物细胞系 • 中被认为是植物细胞中的Hela细胞。BY2细胞可以比较 • 容易的转化外源基因，且转基因细胞团和悬浮培养细 • 胞都较易得到。此外，该细胞系具有高度的同一性，并且 • 生长迅速，经阿非迪霉素(aphidicholin)处理后，可以获得 • 具有高度同周期性的细胞．1周内可以增加80～100倍。 • 因此．BY2细胞已经成为研究细胞周期的模式系统，这 • 使得该细胞系成为分子生物学和细胞生物学研究的良好 • 材料。
• 本文设计将绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素 酶 ，分别连接大的双向T-DNA质粒和最小的 骨架质粒，转入拟南芥和烟草BY-2原生质体 进行瞬时表达。结果表明最小质粒的表达 效率高。确定实验用的载体质粒为大肠杆 菌最小质粒
比对结果
双荧光素酶转录读出分析标准化
• 瞬时表达分析最终结果受到很多内在因素 的影响，比如原生质体的异质性，移液误 差和DNA的含量等。为了对瞬时表达分析进 行标准化，参考了生物统计原理，本文通 过萤火虫荧光素酶（fLUC）和海肾荧光素酶 （rLUC），分别连接上35S CaMV promoter ，形成35Spro::fLUC::35Ster 和 35Spro::rLUC::35Ster，做共瞬时瞬时表达分 析，共测定了八组48个样品在42分钟内的 酶活性变化。
二、Then reason for this problem
• 1、基因的种类繁多，通过试验来区分的难 度大。
• 2、被认为是“黄金标准”的稳定转基因技 术解决了部分基因的功能研究问题，但是 受到遗传扰动这一致命的影响。培养大批 量的转基因植株工作繁重。
• 3、通过正常的生物活动如插入突变沉默和 基因异位表达往往不能得到预期的表型。
三、研究需要
• 随着通过分析基因组规模数据集获得许 多新的 候选基因，例如微阵列转录模式或蛋白质-蛋白质 的互作研究，并且只有少量的能够用于转基因研 究。因此就需要有新的方法来迅速测定基因的功 能和鉴定新基因 。
• 瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但是植 物原生质体瞬时表达分析在研究广泛的分子机制 ，包括信号传导和新陈代谢通道，以及转录的网 络调控是很有用的。
• 1、降低了实验规模和容器的需求量。 • 2、与传统的原生质体富集相比，该系统采用简单
的微滴定沉淀法。 • 3、自动化移液，精确简单。 • 4、周期短，小于2天，严格的无菌环境。
自动化操作平台
自动化操作系统
载体质粒对比分析
• 在任何实验方案中，能够准确又简单的克 隆出所有必需的DNA片段是很重要的，目的 是为了对大型基因组进行系统的功能分析
• 这就说明，在瞬时表达分析时，加入内部 调控报告基因，能够大大降低误差。
转化效率研究
• 分别以拟南芥PSB-L细胞原生质体和烟草BY2细胞原生质体为转录体，用10 μg带有 35Spro::eGFP::35Ster最小载体DNA做瞬时表 达分析，20h后，荧光蛋白量达到30%。如 果想提高含量，需要长时间的孵育。fLUC需 要超过一天。
尼古丁生物合成调控功能因子的筛 选