课题计划项目以与可行性研究报告

河南省重点研发

计划

课题

题目为：琼脂糖自组装膜基底型免疫芯片载体抗体固定研究 项目内容摘要：

研究意义：为了提升免疫芯片对抗体的固定效率，建立多糖纳米膜基底型芯片载体制备的新 方法，为后续免疫芯片的制备提供实验参 研究内容：本文选择多糖中水溶性的琼脂糖为基质，利用分子自组装技玻片为载体， 让琼脂糖、高碘酸钠对玻片表面进行修饰，制备琼脂糖自组装膜载体。利用SEM 、AFM 和 F T I R 对载体进行表征，获得最佳制备条件；利用荧光ImageJ 软件，研究该载 体对2种不同种属来源抗体的固定效率，对琼脂糖自组装膜载体和普通醛基修饰载体对抗 体的固定效果进行对。 关键字琼脂糖;免疫芯片;抗体固定 项目概况 1、主要研究开发内容 选择多糖

中水溶性的琼脂糖为基质，利用分子自组装技玻片为载体， 让琼脂糖、高碘酸钠对玻片表面进行修饰，制备琼脂糖自组装膜载体。利用SEM 、 A F M 和F T I R 对载体进行表征，获得最佳制备条件；利用荧光ImageJ 软件，研究该载体对2种不同种属来源抗体的固定效率，对琼脂糖自组装膜载体 和普通醛基修饰载体对抗体的固定效果进行对。 材料：琼脂糖、3-氨基丙基三甲氧(APTES)(Sigma 公司，美国)， 高碘酸钠、戊二醛、36

%冰乙酸、无水乙醇等均纯(国药集团限公司);F I T C 标记的驴抗兔抗体(上海生工)，F I T C 标记的海生工)。 器械：超纯水机、电子天平、磁力搅拌器、烘干箱，JSM-6360LV 型高低真 空扫F T S 000F X 型的傅立叶变OLYMPUSBX5型1倒置荧 光，N a n o s c o p e I I I a 型原子力。 基片的：25mm ×75mm 光学载玻片用氨水洗液(体积比为氨水∶过氧 化氢∶水=1∶1∶5)置摇摇2h ，取出后用/LHCl 中浸泡过夜，再用超纯水超声10min ，无水乙醇超声清洗2次，每次5min ， 置电热恒温箱(120℃)烘烤2h 。 实验组琼脂糖自组装膜载体制备组进行普通醛基载体制备。 基片表面抗体探针的固定，测定观察载体表面荧光探针的固定效率。 2、主要技术和限1000字） 主要技术： 琼脂糖自组装膜载体制备0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4% 的琼脂糖溶液，微波3min 完全溶解;②将2ml 琼脂糖溶液覆盖在 60℃预热的清洁玻片上;琼脂糖室温凝固后，置37℃烤箱烘干2h;置室温保 存备用;③将上述制备好的琼化60m i n 。接着用0.

普通醛基载体制备：按照文献中的方法制备普通醛基载体。清洗好的玻片浸入APTES活化试剂(丙酮稀释)中20min后取出，玻片用丙酮、去离子水冲洗，

120℃下烘干，然后放入含5%戊二醛溶液中室温下浸泡2h，取出用去离子水冲

洗5min×3次，烘干后，至干燥处保存。

基片表面抗体探针的固定：探针为FITC标记的驴抗兔IgG和兔抗人AFP抗体，

将探针固定至修饰后的载体表面，研究载体对不同蛋白探针的固定效率。取原始

浓度为1mg/ml的探针溶于含20%甘油的PBS溶液中稀释，使探针终浓度分别为

0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml，将探针分子分别链接到修饰后

1.基片上，避光，置于湿盒中，37℃固定3h，然后PBS清洗3次，洗掉未结合的荧光探针，晾干后荧光显微镜检测，获取荧光图像。

经济指标：载体对抗体的固定效率

多糖纳米膜基底型芯片载体成品的销售

3、技术创新点

2.本研究经过前期资料查询，数据库内相关资料充足，课题研究设计经过推敲方

案在课题组通过，已经组织选拔了课题组相关工作人员。

3.课题组成员，高级、中级职称配备合理，有学科带头人，部分工作者有相关经

验。

4.琼脂糖、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)(Sigma公司，美国)，高碘酸钠、

戊二醛、36%冰乙酸、无水乙醇等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);

FITC标记的驴抗兔抗体(上海生工)，FITC标记的兔抗人AFP抗体(上海生

工)。

3.特色和创新：在免疫芯片的制备和应用过程中，大胆采用琼脂糖建立一种新

的免疫芯片载体制备方法，既可以改善实验方法，又可以提高临床提高诊断效率。

4、获得成果和知识产权（此处需要作者自己填写）

以下为项目可行性研究报告

（一）目的意义（限1000字）

免疫芯片，又称为抗体微阵列，是实际应用中最重要、研究最多的一种蛋白

质芯片。免疫芯片技术结合了抗原抗体反应的特异性和芯片高密度集成优势，只

需少量生物样品，一次检测便可获得几种甚至几万种有关的生物信息或疾病的检

测结果。与传统的免疫分析方法相比，免疫芯片最大的优点是能够实现并行、快

速、高通量的检测;同时极大节省时间、试剂，被广泛应用于蛋白质组学研究，

其在疾病诊断、药物筛选、食品安全和环境监测等领域已显示出广阔的应用前景。

免疫芯片制备中，载体的表面修饰及抗体固定是影响芯片检测灵敏度的关键因

素。目前，免疫芯片载体表面修饰可大致分为两类:二维表面修饰和三维表面修

饰。二维表面修饰包括聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、巯基修饰、链霉亲

合素修饰等，它们是通过共价键或特殊分子间的高亲合力把蛋白质固定在载体表

面，所以对蛋白质的固定比较牢固，蛋白质的构象变化较少，有利于保持蛋白质

的天然活性。但是二维表面修饰技术制备的载体在发展过程中仍存在不少问题，

如:引起抗体蛋白质性质不稳定的问题，动力学检测范围窄等问题。三维表面修

饰是在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，这些凝胶或多聚物又可以通过化

学反应引入活性基团，以共价结合和物理吸附的方式把蛋白固定在载体表面。琼

脂糖一种拥有多种生物活性的高聚物，生物相容性良好，有研究推断琼脂糖自组

装膜基底可能会提升免疫芯片对抗体的固定效率，建立多糖纳米膜基底型芯片载

[1]。

体制备的新方法，为后续免疫芯片的制备提供实验参考和理论支持

（二）国内外同类产品和技术情况（限500字）

[2]

已有大量研究证明，三维结构的载体对蛋白质的固定量比二维平面载体大

得多，而且凝胶的固-液环境使固定在上面的蛋白质不易失去活性。所以三维修

饰表面是近年来较受关注的修饰方法。研究表明

[3]，多糖膜具有三维多孔结构，

经水化后可在内部形成固-液状态的水凝胶结构，这种三维、多孔结构以及湿润

的微环境不但能固定足够的蛋白质，同时还可以防止蛋白质变性失活。

琼脂糖是一种拥有多种生物活性的高聚物，有着很好的生物相容性，其在载

玻片表面形成的自组装结构具有类似于聚丙烯酰胺的水凝胶特征，这三维自组装

结构又可以通过化学反应引入醛基基团，即可与抗体分子的氨基发生共价偶联。

具有这种三维结构的载体对蛋白质的固定量比二维平面载体大得多，而且凝胶的固-液湿润环境使固定在上面的蛋白质不易失去活性，因此更有利于固定抗体探

针分子。有研究表明[4]:壳聚糖氧化自组装膜修饰玻片与抗体结合效率高，荧光

信号强，点的密度及数量等都要优于普通醛基化玻片。琼脂糖是一种多糖，加热

后易溶于水，不同浓度的琼脂糖在玻片上形成的膜的厚度和孔径大小也有差异，

膜的厚度和孔径的大小会直接影响蛋白质的固定。

参考文献

[1]SjbergＲ，MattssonC，AnderssonE，etal．Explorationofhigh-den- sityproteinmicroarraysforantibodyvalidationandautoimmunity

profiling［J］．NewBiotechnol，2016，33(5):582-592.

[2]ThkSM，BonabiA，NordbergME，etal．Thiol-enemicrofluidicdevicesformicrochipelectrophoresis:Effectsofcuringconditionsandmono mer

compositiononsurfaceproperties［J］．JChromatog-raphyA，2015，1426: