多糖含量测定方法

多糖含量的测定

粗多糖中的总糖含量使用苯酚-硫酸法进行测定，还原糖用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，多糖含量= 总糖- 还原糖。

1、总糖含量测定

实验原理：

多糖在硫酸作用下，先水解成单糖，并脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

试剂：

浓硫酸（分析纯）、5%苯酚溶液（分析纯）、标准葡萄糖。

操作步骤：

①制作标准曲线：准确称取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1 mg/ml 的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml。1 ml标准液分别加入5% 苯酚溶液1 ml，并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。摇匀，30℃放置30 min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。

②样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。

2、还原糖含量

实验原理

碱性条件下，DNS可与还原糖反应生成3-氨基-5-硝基水杨酸。此物质在煮沸条件下成棕红色，且颜色深浅在一定范围内与还原糖含量成线性关系。据此可通过测定OD值确定还原糖含量。

试剂及配制：

浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液。DNS显色液：称取3.25g DNS溶于少量蒸馏水中并转移至500ml容量瓶中，加入2mol/L的NaOH溶液162.5ml，再加入7.5ml的丙三醇，摇匀，加蒸馏水定容至500ml，摇匀。

操作步骤

①标准曲线制作：在6支试管中分别加入1mg/ml葡萄糖标准溶液0.00ml，

0.10ml，0.20ml，0.30ml，0.40ml，0.50ml，补蒸馏水至0.5ml，然后加入DNS

试剂1.5ml，充分混匀。置于沸水浴中煮沸5min，然后迅速流水冷却，并分别向试管中加入4ml蒸馏水，混匀。在540nm处读OD值。以葡萄糖浓度（μg/ml）为横坐标，以OD值为纵坐标制作标准曲线，得到其线性回归方程。

②样品含量测定：吸取0.5ml样品液，按照上述步骤操作测定OD值，并代入回归方程中计算样品中的还原糖含量。