响应面法优化玉米醇溶蛋白提取工艺

响应面法优化玉米醇溶蛋白提取工艺
李丽杰1，王英利1，赵一楠2
(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.好丽友食品有限公司，北京 100015)摘 要：采用乙醇为提取剂，以玉米粉为原料提取玉米醇溶蛋白。

探讨了液料比、浸提时间、乙醇体积分数、浸提温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响。

在单因素试验结果的基础上，确定各因素的分析水平，利用响应面中心组合法设计试验方案。

以提取率为响应值，建立数学模型并得到玉米醇溶蛋白提取工艺优化组合为浸提温度55℃、浸提时间2.5h 、液料比9:1(mL/g)、乙醇体积分数80%，并分析了双因素间的交互效应。

关键词：玉米粉；醇溶蛋白；响应面法；提取率；交互效应
Optimization of Zein Extraction from Corn Flour by Response Surface Methodology
LI Li-jie 1，WANG Ying-li 1，ZHAO Yi-nan 2
(1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot
010018, China ；
2. Orion Food Co. Ltd., Beijing 100015, China)
Abstract ：In this study, zein was extracted from corn flour using ethanol extraction. Response surface methodology was employed to establish optimum conditions for zein extraction. The effects of extraction time, extraction temperature, solid-to-liquid ratio and ethanol concentration on extraction ef fi ciency were explored. As a result, a mathematical model was established. The optimum conditions for zein extraction were found to be extraction at 55 ℃ for 2.5 h using 80% ethanol at a solvent-to-solid ratio of 9:1 (mL/g). Moreover, we investigated the pairwise interactions of the various extraction conditions.Key words ：corn fl our ；zein ；response surface methodology ；extraction ；interaction 中图分类号：TS201.21 文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2012)24-0165-05
收稿日期：2012-09-05
玉米醇溶蛋白是玉米中主要的贮藏蛋白，约占玉米总蛋白含量的68%以上[1]。

玉米醇溶蛋白虽缺乏赖氨酸和色氨酸，但含有大量的谷氨酸和脯氨酸，并且还富含亮氨酸和丙氨酸[2]。

玉米醇溶蛋白在许多领域都有很广泛的应用，可用作果蔬食品保鲜[3]、生物可降解塑料[4]以及黏合剂[5]，醇溶蛋白用甲醛处理后可做成很好的纤维，用于纺织品行业，还可用来生产玉米肽(高F 值寡肽、疏水肽等活性肽)、玉米蛋白油脂模拟品、糖果、口香糖等食品[6-7]。

目前常用的从玉米中提取醇溶蛋白的方法主要是以玉米蛋白粉[8-9]、玉米渣[10]和干法粉碎的玉米粉[11]为原料，采用机溶剂提取法、超声波提取法、超临界CO 2提取等方法。

诸多方法中乙醇浸提法简单易行并且提取率高，变性程度最小[12]。

商业上玉米醇溶蛋白通常是利用亚硫酸分离胚芽，纤维素，提取淀粉后，从副产品中提取醇溶蛋白。

但是该过程将醇溶蛋白分子中的二硫键切断，在分子水平上破坏聚集态玉米醇溶蛋白的天然结构，进而改变了天然玉米醇溶蛋白的特性[13]。

因此，以玉米粉为原料提取醇溶蛋白成为未来发展的新趋势。

提取醇溶蛋白后的玉米残渣可进行酒精发酵，降低酒精生产成本[14]。

玉米醇溶蛋白中含有大量的疏水性残基，如脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸，所以，玉米醇溶蛋白有较强的疏水性。

同时，玉米醇溶蛋白还含有一些极性基团，如谷氨酰胺、天冬酰胺和谷氨酸。

因此，玉米醇溶蛋白具有独特的溶解性，不溶于水，也不溶于无水醇类，但可以溶解于体积分数60%～95%的醇类水溶液中[8]。

乙醇水溶液的溶剂组成对玉米醇溶蛋白的溶解度有重要影响，通过优化溶剂组成可极大提高玉米醇溶蛋白的提取率[13]。

本研究旨在以玉米粉为原料，以乙醇为提取剂，研究玉米醇溶蛋白的提取工艺，为优化玉米醇溶蛋白的生产工艺、提高玉米的综合利用价值、强化玉米副产品的深加工提供理论依据。

1
材料与方法1.1 材料与试剂
玉米粉、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等(均为分析纯) 天津市江天化工技术有限公司；所用其他试剂均为分析纯。

1.2
仪器与设备
HH 温度计数显恒温水浴 金坛市金城国盛试验仪器厂；BS-124S 电子天平 北京赛多利斯仪器公司；UV-2100紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；TDL-5台式低速大容量离心机 江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法
1.3.1
玉米醇溶蛋白的提取工艺流程
玉米粉→粉碎过筛(70目)→加入80%乙醇(液料比10:1，mL/g)→调节温度(60℃)→浸提2h →离心分离(3000r/min ，15min)→上清液→冷水(10℃)稀释乙醇体积分数至40%→调pH6.2静置过夜→沉淀水洗至中性→室温风干→磨碎成品1.3.2
玉米醇溶蛋白标准曲线的制作
[15]
先提取玉米醇溶蛋白，并用凯氏定氮法测定其中的蛋白含量，将含量最高的样品作为标准样品，称取250mg 样品于250mL 容量瓶中，用体积分数80%的乙醇完全溶解并定容。

再将该标准溶液用体积分数80%的乙醇配制成质量浓度为0.1～1mg/mL 的梯度溶液。

以各梯度溶液吸光度为纵坐标，以各标准溶液质量浓度为横坐标，制作标准曲线。

参照标准曲线即可快速得到提取液中醇溶蛋白的浓度。

回归方程为：y = 0.8152x + 0.0086，R 2=0.9999。

1.3.3
玉米醇溶蛋白含量及提取率的测定
提取液中醇溶蛋白的含量/mg=提取液中醇溶蛋白的质量浓度/(mg/mL)×提取液的总体积/mL ×配制标准溶液的蛋白质样品的纯度/%
醇溶蛋白的提取率/%=
提取液中醇溶蛋白的含量/mg
玉米粉中醇溶蛋白的质量/mg
×100
玉米粉中醇溶蛋白的质量/mg=玉米粉的质量/mg ×玉米粉中蛋白质的含量/%×65%(玉米粉中醇溶蛋白含量按总蛋白含量的65%计)[16]
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析2.1.1
浸提时间对提取率的影响
0.5 1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
䯈/h
⥛/%
图 1
浸提时间对玉米醇溶蛋白提取率的影响
Effect of extraction time on the extraction ef fi ciency of zein
Fig.1
准确称取2g 玉米粉6份，浸提温度设为60℃，液料比
(浸泡每克玉米粉使用乙醇的毫升数)8:1(mL/g)，乙醇体
积分数80%，浸提时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h 和3.0h 。

浸提后离心提取上清液，稀释至一定倍数后在278nm [17]波长处下用紫外分光光度计测其吸光度，计算提取率，结果见图1。

由图1可知，在0.5～1.5h 内醇溶蛋白提取率随时间延长呈显著上升趋势，当浸提时间升至1.5h 时，提取率达到峰值为90.25%，之后提取率随着时间的延长，变化趋于平稳，且2h 后基本保持不变，而2.5h 之后提取率略有下降。

这说明醇溶蛋白开始较易溶解于体积分数80%乙醇溶液中，并且此过程最少需要1.5h ，之后接近溶解饱和度。

而随着浸提时间的延长溶液挥发量越大，损失较多提取率反而下降，因此，为获得较好的提取效率，确定醇溶蛋白的浸提时间最少为1.5h 为宜。

2.1.2
浸提温度对提取率的影响
准确称取2g 玉米粉5份，液料比8:1(mL/g)、乙醇体积分数80%、浸提时间1.5h 浸提温度分别为30、40、50、60、70℃，浸提后离心提取上清液，稀释至一定倍数后在278nm 波长处用紫外分光光度计测其吸光度，计算提取率，结果见图2。

⏽ /ć
⥛/%
图 2
浸提温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响
Effect of extraction temperature on the extraction ef Fig.2
fi ciency of zein
由图2可知，在30～40℃之间醇溶蛋白提取率基本不变，但在40～60℃之间，醇溶蛋白的提取率随着温度的升高而快速增加，在60℃时达到最大值，其醇溶蛋白含量为128.55mg ，提取率为85.99%。

60℃以后提取率有下降趋势。

其原因可能是醇溶蛋白在温度高于60℃时会发生部分变性，造成醇溶蛋白的提取率下降。

同时考虑到乙醇在较高温度(高于70℃)易挥发损失，因此确定浸提温度为60℃。

2.1.3
液料比对提取率的影响
准确称取2g 玉米粉6份，浸提时间1.5h 、浸提温度60℃、乙醇体积分数80%，液料比分别为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1(mL/g)，浸提后离心提取上清液，稀释至一定倍数后在278nm 用紫外分光光度计测其吸光度，计算提取率，结果见图3。

⎆ ↨(mL /g)
⥛/%
图 3
液料比对玉米醇溶蛋白提取率的影响
Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction ef fi ciency of zein
Fig.3
由图3可知，液料比从2:1升至6:1时醇溶蛋白的提取率增长较快，之后增长趋缓。

液料比较低时，乙醇添加量过少，无法充分溶出醇溶蛋白，随着乙醇溶液添加量的逐渐增加，醇溶蛋白的提取量逐渐增加；一般来说，溶剂用量越大，提取率越大，但过高的液料比会造成浪费。

乙醇添加量对醇溶蛋白提取成本影响较大，并且由图3可知，当液料比10:1时提取率为88.82%，而在继续增加液料比，提取率反而略有下降，因此，综合考虑提取率与成本的关系，确定液料比为小于10:1(mL/g)为宜。

2.1.4
乙醇体积分数对提取率的影响
准确称取2g 玉米粉5份，浸提时间选定1.5h 、浸提温度60℃、液料比8:1(mL/g)，乙醇体积分数分别为70%、75%、80%、85%、90%，浸提后离心提取上清液，稀释至一定倍数后在278nm 波长处用紫外分光光度计测其吸光度，计算提取率，结果见图4。

Э䝛ԧ⿃ /%
⥛/%
图 4
乙醇体积分数对玉米醇溶蛋白提取率的影响
Effect of ethanol concentration on the extraction ef Fig.4
fi ciency of zein
由图4可知，醇溶蛋白溶液的提取率随乙醇体积分数的增加呈先上升后下降的趋势，当乙醇体积分数在70%～80%之间时，提取率逐渐增加，在80%时达到最大值，此时醇溶蛋白量为134.43mg ，提取率为89.92%，乙醇体积分数80%以后提取率呈现下降趋势。

其原因可能是β-和γ-醇溶蛋白在乙醇体积分数较高的情况下溶解度降低，造成醇溶蛋白的提取量下降[18]。

因此把乙醇体积分数定为80%。

2.2
响应面试验结果与分析
根据单因素试验结果，以提取率为试验指标，用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验方案，以浸提
时间，浸提温度，液料比与乙醇体积分数作为响应面试验的因素，以4因素3水平正交二次旋转组合设计进行试验，响应面试验设计及结果见表1。

表 1
响应面试验设计与结果Experimental design and results for response surface analysis
Table 1
试验号温度/℃时间/h 液料比(mL/g)
乙醇体积分数/%提取率/%
160 2.010:18087.61260 1.58:1
8067.91
370 2.510:17590.32460 2.58:18083.93560 2.08:18071.32670 2.56:17556.81760 2.08:17564.97850 2.510:18591.05960 2.06:18048.771060 2.08:18558.371150 2.08:18077.471250 1.510:17585.411360 2.08:18071.261470 1.56:18554.091550 1.56:17555.151670 1.510:18572.031750 2.56:18543.221860 2.08:18071.281960 2.08:18071.312070 2.08:18074.0221
60
2.0
8:1
80
71.29
根据响应面分析试验得出的数据可知，当浸提温度50℃、浸提时间2.5h 、液料比10:1(mL/g)，乙醇浓度乙醇体积分数为85%时，玉米粉醇溶蛋白的提取率最高，达到91.05%。

为了证实结果的再现性，又在该条件下进行了两次实验，结果玉米醇溶蛋白的提取率分别为93.26%和90.45%，均高于其他条件组合下的提取率。

所以，以上结果说明浸提温度50℃、浸提时间2.5h 、液料比10:1(mL/g)、乙醇体积分数85%是最佳的提取条件，并且试验结果具有再现性，是可行的。

采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值，及
采用统计学的F 值、P 值与方差分析检验模型方程多项式各系数的拟合和回归。

根据试验结果建立的提取率数学模型为：
提取率/%＝71.1－1.73A ＋8.01B ＋16.84C －3.30D ＋0.11AB －3.3AC ＋6.17AD ＋4.14BC －1.53BD ＋0.25CD ＋4.69A 2＋4.87B 2－2.86C 2－9.38D 2 (1)
式中：A 为浸提温度/℃；B 为浸提时间/h ；C 为液料比(mL/g)；D 为乙醇体积分数/%。

回归方程中各变量对响应值影响的显著性用F 检验来判定，概率P 值越小，则相应变量的显著程度越高，P ＜0.01时影响为高度显著，P ＜0.05影响显著。

根据表2中的显著性检验结果，4个因素对玉米醇溶蛋白提取率影响主次顺序依次为液料比＞浸提时间＞乙醇体积分数＞浸提温
度，其中液料比的影响是高度显著的，浸提时间的影响显著，乙醇体积分数的影响较显著，而浸提温度的影响是不显著的。

从回归方程各项方差检验可看出，方程的一次项及交互项显著性参差不齐。

提取率数学模型的P 值小于0.0001，表明该试验建立二次方程模型高度显著可靠，能较好的描述提取率随各因素的变化并用于提取率的分析和预测。

表 2
回归方程方差分析Analysis of variance for the fi tted regression equation Table 2 项目平方和自由度均方F 值P 值回归模型
3645.3614260.3892.67＜0.0001A 5.9501 5.950 2.1200.1958B 128.31128.345.670.0005C 2835128351009.08＜0.0001D 21.78121.787.7500.0318AB 0.02010.0207.207×10－3
0.9351
AC 88.71188.7131.570.0014AD 60.91160.9121.680.0035BC 137.281137.348.860.0004BD 3.7301 3.730 1.3300.2929CD 0.50010.5000.1800.6878A 256.26156.2620.020.0042B
2
60.53160.5321.540.0035C 220.89120.897.4400.0343D 2224.641224.6479.950.0001残差16.866 2.810失拟相16.862
8.43014785.69
＜0.0001
净误差
2.280×10
-3
4
5.700×10
－4
根据表2中的显著性检验结果，去除模型中的不显著项，可以得到简化了的提取率数学模型：
提取率/%＝71.1＋8.01B ＋16.84C －3.30D －3.3AC ＋6.17AD ＋4.14BC ＋4.69A 2＋4.87B 2－2.86C 2－9.38D 2 (2)2.3 双因素间交互作用
2.3.1
浸提时间与液料比的交互作用
在浸提温度60℃，乙醇体积分数80%条件下，研究浸提时间与液料比对醇溶蛋白提取率的交互影响，从图5可以看出，提取率随着液料比的增大、浸提时间的延长而提高，并且浸提时间越长，液料比越高，二者结合对提取率的影响越大，存在显著的交互作用。

1.5
1.7 1.9
2.1 2.3 2.5
⍌ 䯈/h
⎆ ↨(m L /g )
590
85
80
75
70.0111
10:1
9:18:17:16:1 1.51.71.92.12.32.5110
100908070605040
⎆ ↨(m L /g )⍌ 䯈/h ⥛/%
图 5 浸提时间与液料比响应面分析图和相应等高图
Response surface and contour plots showing the effects of
Fig.5
extraction time and solid-to-liquid ratio on the extraction ef fi ciency of zein
2.3.2 浸提时间与乙醇体积分数的交互作用
1.5
1.7 1.9
2.1 2.3 2.5
⍌ 䯈/h
Э䝛ԧ⿃ /%
5
7075
80
60
65
65
8583
817977751.51.71.92.12.32.5
110
100908070605040
Э䝛ԧ⿃ /%⍌
䯈/h ⥛/%
图 6
浸提时间与乙醇体积分数响应面图和等高线图
Response surface and contour plots showing the effects of extraction
Fig.6
time and ethanol concentration on the extraction ef fi ciency of zein
在浸提温度固定为60℃，液料比固定在8:1(mL/g)条件下，研究浸提时间与乙醇体积分数对醇溶蛋白提取率的交互影响，从图6可知，随着浸提时间的延长，提取率呈现明显上升的趋势，而随着乙醇体积分数的增大，提取率呈现先上升后下降的趋势，参照等高线，可以看出浸提时间和乙醇体积分数两者有较强的交互作用。

2.3.3
浸提温度与乙醇体积分数的交互作用
在浸提时间2h 、液料比8:1(mL/g)条件下，研究浸提温度与乙醇体积分数对醇溶蛋白提取率的交互影响，从图7可知，随着乙醇体积分数增大提取率呈现先上升后下降的趋势，而随着浸提温度的升高提取率呈现先下降后趋于平缓的趋势。

参照等高线，两者结合对提取率的影响明显
不同于单个因素的影响，说明浸提温度和乙醇体积分数因素存在一定的相互作用，而且这种作用是显著的。

⍌ ⏽ /ć
Э䝛ԧ⿃ /%
570.0111
70.0111
75
85
838179
777550556065
70
100
908070605040
Э䝛ԧ⿃ /%⍌ ⏽
/ć ⥛/%
图 7 浸提温度与乙醇体积分数响应面分析图和相应等高图Response surface and contour plots showing the effects of
Fig.7
extraction temperature and ethanol concentration on the extraction
fi ciency of zein
ef 2.4 优化提取工艺参数的验证
为了进一步确证计算机模拟得到最佳点的值，对回
归方程(2)取一阶偏导数等于零。

得到玉米醇溶蛋白提取的最优工艺组合，其理论提取率为98.33%，对应的提取条件为浸提温度54.53℃、浸提时间2.48h 、液料比9.08:1(mL/g)、乙醇体积分数78.87%，考虑到实际工艺的控制方便，将最佳提取条件修正为：浸提温度55℃、浸提时间2.5h 、液料比9:1(mL/g)、乙醇体积分数80%。

以所得最佳提取条件进行3次验证实验，测得提取率为98.02%，与模拟计算机值基本接近，表明预测值和真实值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

3 结 论
3.1
根据响应面中心组合试验结果，液料比对于提取率
的影响最为显著，其次是浸提时间、乙醇体积分数，而浸提温度的影响最不显著。

在双因素交互作用方面，浸
提时间与液料比、浸提时间与乙醇体积分数、浸提温度与乙醇体积分数之间的交互作用都是显著的。

3.2
利用响应面分析法建立从玉米中提取醇溶蛋白工艺条件的数学模型，并得出最佳工艺条件为：浸提温度55℃、浸提时间2.5h 、液料比9:1(mL/g)、乙醇体积分数80%，此时提
取率为98.02%。

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