第七章 真菌的分子生物学鉴定方法

和rDNA序列。线粒体基因组为双链环状结构，进化速
率比核基因组快，一般用于种内及种间的系统分析。
真菌编码的18S、28S和5.8S核糖体基因为多拷贝基因家族，有高
度相似的DNA序列，每个重复单元由转录区和非转录区组成。非转
录区被基因间隔区（intergenic spacer IGS）打断，转录区由两个内 转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）打断，ITS将18S、
Genebank Data: / 荷兰的霉菌中心保藏所： http://www.cbs.knaw.nl/
第七章
真菌的分子生物学鉴定方法
真菌的形态特征复杂，而且形态特征和生理生 化指标随着环境的变化而不稳定，因此，在传统 的真菌分类中常引起分类系统不稳定或意见分歧。 随着生物化学、遗传学以及分子生物学等相关学 科的发展，同时也是真菌分类学自身发展的客观 需求，在真菌的现代分类学中引入了分子生物学 的鉴定方法。
例——捕食线虫真菌的分类发展
粘球和 非收缩环
节丛孢
收缩环
单顶孢
菌网
隔指孢
粘性分枝
分子生物学鉴定方法包括DNA碱基组成 (G+C)mol%、限制性片段长度多态性（RFLP）、 随机扩增多态性 (RAPD) 、Southerm印迹分析 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）以及小亚基rDNA(或 rRNA)序列测定等。 过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐 渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和 客观的反映系统发育的规律对真菌进行自然分 类，达到人们追求已久的自然分类目的，无疑 是分类学发展过程中的重要转折。
那些具有表型特征相似的菌株在分子水平上给以
界定。一般而言，同一种内的菌株必须是DNA同 源性≥ 70%。核酸分析技术已经在细菌分类中 被广泛应用，而且近年来已被真菌学家们采用。
（一）DNA分子杂交技术 所有生物体都是以DNA的形式通过碱基序列来贮存遗传信息，不
同的生物碱基序列都不同，种的差别越大，其DNA碱基序列差别越
位点的数目和距离就发生了改变，产生一些大小不等的DNA片Байду номын сангаас。
RFLP分析已经被有效用于真菌种及种以下类群的系统学研究、 群体水平的变异分析及菌系鉴定，很少用于较高级分类群的系统学 研究。
（三）随机扩增多态性DNA（RAPD）分析 随机扩增DNA多态性分析（randomly amplified polymorphic DNA RAPD）又称随机引物多聚酶链式反 应(Arbitrary Primer Polymerase Chain Reaction AP-PCR) 是Williams 等与Welsh和McClelland于1990年分别同时创 立的一种相同的DNA分子标记技术。它应用短的随机序 列引物（一般为10个碱基）,在对研究对象的遗传背景一 无所知的条件下以DNA为模板进行ＰＣＲ扩增,结果基因 组的许多位点同时得以扩增，再应用凝胶电泳分析ＰＣＲ 产物,并检测基因多个位点的多态性。
一、真菌DNA碱基组成的分类鉴定方法 G＋C mol%测定：使用DNA中（G＋C）摩尔百分比 的测定来作为真菌分类的一个技术方法是基于DNA含有 四种碱基，不同的有机体（G＋C）：（A＋T）的摩尔百
分比却各不相同，每个有机体的G＋C mol%均有较稳定
的值。 大量的研究表明，脊椎动物(G+C)mol%为35%—45%，细 菌为24%—78%，真菌为20%—60%。
在使用G＋C mol%作为真菌分类的一个指标 时，必须注意的是两个有机体的DNA碱基组成相 同，而其DNA序列上可以有很大的不同，只有当 它们也具有大量共同的表型性状，或在遗传结 构方面也彼此相近时，才能说它们在遗传学和 进化关系上相近。
(G+C)mol%在真菌分类鉴定中主要有两种作用：
（1）有助于界定真菌的种、属 真菌的各种、属、纲、门之间都有其特定的 DNA (G+C)mol%范围，遗传关系相近的有机体有 相似的DNA (G+C)mol%。 两个菌株之间 (G+C)mol%差别在4%—5%之间，可 以认为是同一种内的不同株；若差别在10%—15%之 间，可以认为是同属内不同的种；差别在20%—30% 之间，则认为是不同属或不同科内的真菌。
大。因此，通过不同真菌DNA碱基同源性分析，可以对真菌种、属 间的亲缘关系做出分析鉴定。对大量DNA样品进行全序列分析， 从实践的角度仍然是相当困难的，然而，DNA片段杂交可以得到 DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同真菌基因组之间的
同源性。
变性的单链DNA在一定条件下可以靠碱基的配对而复性成双链， 这就是DNA杂交的基本原理。同种异株的真菌基因组DNA序列差 异较小，一般认定在35%以内。
聚类树状图与基于ITS构建的分子系统发育图，表明该
聚类树状图不适于分析种间亲缘关系。
三 rDNA序列分析的方法及应用
基因序列在生物进化过程中的改变速率是一定的，目前
很多真菌学家在真菌分子系统学研究的基本方法之一是 对菌体的某一段DNA序列进行同源性比较,构建系统树, 以此探讨它们的系统演化关系。目前现有的序列资料, 常用于真菌系统学研究的基因片段主要有线粒体基因组
（二）真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP），将目标DNA序列经一定数目和种类的限 制性内切酶(RE)进行酶切,由于不同生物体的基因组DNA在限制性 内切酶的酶切位点的遗传信息有差异, 限制性内切酶在其上的识别
Orbilia Fr.(1849), Orbiliaceae, Anamorphs
Arthrobotrys, Dactylella, Dicranidion, Dwayaangam,
Helecoon, Monacrosporium,Trinacrium,c.34(on wood etc., sometimes nematode-trapping),widespread. See Baral(SA 13: 113,1994; concept), Benny et al.(CJB 56: 2006,1978;biol.)
5.8S 和28S rDNA分开。
《真菌字典》由国际真菌学研究的权威机构———— 英国国际真菌研究所出版 《DICTIONARY of THE FUNGI》 Trichoderma Pers.(1794), anamorphic Hypocrea, 34(esp. in soil), widespread. Sometimes of use for controlling pathogenic fungi(see antagonism). See Rifai(Mycol.Pap.116, 1969: Key),Bissett(CJB 62:924,1984; Key to sect. Longibrachiatum), Hayes et al.(Anal. Biochem. 209:176,1993; methods for karyotyping),…………. Lieckfeldt et al.(Appl. Environm. Microbiol. 65:2418,1999; T. viride). See Hypocrea.
RAPD是一种比较精细的分子标记技术，单个碱基的改 变有可能对扩增片断的多态性产生明显的影响。
国内有人利用RAPD对白色念珠菌、淋球菌、水稻白叶 枯病菌进行分型取得了很好的结果。 黄勃等人利用 RAPD 技术对拟青霉属菌株进行分类鉴定时，发现
RAPD 指纹图谱在拟青霉属不同种间具有明显的种的
特异性，可以区别所有形态近似的种类，但对比RAPD
（2）可以作为判定真菌科属间的亲缘关系的参 考标准。
(G+C)mol%其主要作用在于否定，即 (G+C)mol%不相同的菌，肯定回答它们不是同种， 而(G+C)mol%相同的菌，就不能肯定回答是同种， 只有当它们同时具有大量共同的的表型性状时， 才能说明它们的遗传学和亲缘关系上相近。
二、核酸分析技术 核酸分析技术大都以DNA同源性为基础，这就为
RAPD技术是群体遗传研究、菌物鉴定等的很好的分子 标记，已经被成功地用于动物、植物、人和微生物的遗 传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学诊断、遗传 图谱构建和系统学研究等。 在分析生物间系统发育关系、分析突变以及亲缘关系鉴 定等方面显示出卓越的功能,一些表型上不能反映的遗传 物质的细微变化都可以通过RAPD技术显示出来。