专题3植物逆境胁迫时生理特征的变化植物的抗旱性是植物在干旱

专题3、植物逆境胁迫时生理特征的变化植物的抗旱性是植物在干旱环境中生长、繁殖或生存,以及在干旱解除后迅速恢复生长的能力。

通过从生理角度对植物抗旱性比较可以为抗旱育种与栽培生产提供参考一定程度上的参考。

近年来，气候全球性恶化所引发干旱的周期越来越短, 程度越来越重。

对粮食生产构成了严重的威胁。

我国是水资源十分短缺的国家之一，干旱缺水地区面积占全国国土面积52%，受旱面积达200～270 万公顷, 其中完全没有灌溉条件的旱耕地有4133.3万公顷，仅靠改进耕作栽培技术，是不太现实的，那就让我们必须从作物上来解决这个问题。

一是直接提高作物产量的遗传潜力；另一方面是改良各种非生物和生物胁迫因素的抗逆性，比起前者，后者的潜力和可行性受到广泛的关注和重视。

玉米和高粱是我国北方的主要耕种作物，其在畜牧业、工业上也发挥了重要的作用,因此本实验想通过对它们的生理抗旱性测试比较，来更好地指导农业生产，保证国家粮食安全。

实验目的：
1、研究不同种类逆境对不同种类植物的影响；
2、研究不同种类植物对不同逆境的应激性和适应能力程度。

实验原理：
在自然界中，植物并不是总是生长在适宜的条件下，经常会遇到不利于植物生存和生长的环境条件，凡是对植物生存与生长不利的环境因子，总称为逆境（stress environment）。

逆境有自然的、人为的、化学的、物理的和生物的，例如大气污染、盐碱、低温、干旱和病虫害等。

任何一种使植物内部产生潜在有害变化的环境因子，称为胁迫（stress）；植物受到胁迫而发生的相应变化称为胁变（strain）。

胁变有两种，胁迫解除后可恢复正常的胁变称为弹性胁变（elastic strain）即可逆伤害；胁迫解除后不能恢复正常的胁变称为塑性胁变(plastic strain)，实际上是不可逆伤害，然而在一定范围内植物对塑性胁变是可以忍受，但超过一定范围，植物将会死亡。

植物对各种不利的环境因子都具有一定的抵抗或忍耐能力，这种能力称为抗逆性（stress resistance）,简称抗性。

抗性是植物对环境的适应性反应，是一种遗传特性，是在不良环境（特指逆境）条件下逐步形成的，这种抗逆遗传特性在特定不良环境诱导下，植物逐步获得的过程，称为抗性锻炼。

植物可能通过抗性锻炼提高抗逆性。

植物对逆境的抵抗主要有两种方式，避（逆）性和耐（逆）性。

避逆性（stress avoidance，有人译为御逆性），目前还没有比较好的定义，它的有实际含义是植物通过物理障碍或生理生化途径完全排除或部分排除逆境对植物体产生的直接有害效应来抵抗逆境的方式。

耐逆性
（stress tolerance）是指植物虽然经受逆境的直接效应，但可通过代谢反应阻止，降低或修复逆境效应造成的损害，来抵抗逆境的方式，这种抗逆性是在保持正常或较正常的生理活动条件下的抗逆性。

实验材料
1、材料
从附中校园采集肥沃土壤，与购买的有机土壤混匀后，分别向每个花钵中加入一定量的土壤，然后每个花钵中播种2-3粒植物种子（小麦、玉米、蚕豆等由各个实验小组自己决定），播种后喷洒营养液，并将花钵置于恒温光照培养箱（光照度60，12h；黑暗8h）中，定期喷洒营养液。

2、处理方法
当幼苗长至10cm高度时，停止营养液喷洒，对幼苗进行相应的逆境处理。

如干旱处理方法：采用5%、10%、15%、20%PEG6000处理，模拟水分胁迫，48h后开始实验。

3、指标的测定
1、质膜透性；
2、叶绿素含量测定；
3、MDA含量测定；
4、pro含量测定；
5、POD酶活性的测定
1.3 实验方法
质膜透性的测定参考附一
叶绿素含量测定参考附二
MDA含量测定参考附三
pro含量测定参考附四
POD酶活性的测定参考附五
附一、植物细胞质膜透性的测定
实验目的
植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。

但植物常受到外界不良因子的影响，而不同植物种类其抗逆性则不同。

用电导仪率法测定植物质膜透性的变化，可作为植物抗逆性的生理指标之一。

本实验主要测定低温对
细胞质膜透性的影响，并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。

实验原理
植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。

植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。

各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。

如极端的温度、干旱、盐渍，重金属离子（如Cd2＋等）和大气污染物（如SO2、HF、O3）等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，外液电导率增大。

该变化可用电导仪测定出来。

细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。

实验材料、仪器设备
1.材料：植物叶片。

2.仪器设备：电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml 烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。

实验步骤
1.清洗用具
所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，干燥后备用。

2.实验材料的准备及处理
选取叶龄相似的植物叶片，剪下后用湿布包住。

实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1～2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1cm2的小叶片（或用直径为1的打孔器钻取小园片），注意除掉大叶脉。

将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。

作如下处理：A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15～30min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入蒸馏水50ml。

B杯常温处理，加入蒸馏水50ml。

将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气20—30min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸馏水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10～15min（煮沸时间依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。

然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。

3.电导率测定
用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定蒸馏水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：
电导率测定记录表
附二、植物叶绿素含量测定——丙酮提取法
高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。

叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。

叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。

在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。

叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。

实验原理
叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。

叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数
即可计算叶绿素含量。

利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

其数学表达式为：
A=Kbc
式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。

叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。

叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。

根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：
A663=82.04Ca+9.27Cb （1）
A645=16.76Ca+45.60Cb （2）
只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。

实验仪器与试剂
1．材料：植物绿色叶片。

在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半叶和黄色半叶为试材。

2．仪器：分光光度计；天平；研钵；滤纸；漏斗；5ml移液管；打孔器；滴管；剪刀；25ml 容量瓶；毛刷；擦镜纸。

实验方法
1．取样：用毛笔或毛刷清除叶片表面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取0.25dm-2的叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。

（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排放，故不设重复）。

注意取样时要避开大的叶脉。

如果需要计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干，用于测定干重。

2．研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。

3．读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。

将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。

第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。

将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。

每个样品重复测定3次。

注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。

4．结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式计算叶绿素a、b浓度和总浓度。

再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。

附三、植物组织MDA含量测定
实验目的
1．掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；
2．深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA含量测定的意义；
3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA形成的关系；
4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA含量；
5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

实验原理
植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。

活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。

其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。

因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

MDA 在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA ）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet —nine ），又名三甲川，该物质在532nm 处有最大光吸收，在600nm 处有最小光吸收。

由于TBA 也可与其它物质反应，并在532nm 处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm 下的吸光度，利用532nm 与600nm 下的吸光度的差值计算MDA 的浓度。

即：A 532－A 600＝ε·C·L
式中，A 532和A 600分别表示532nm 和600nm 处的吸光度值，C 是MDA 浓度，L 为比色杯厚度，ε=155L·mmol -1·cm -1。

TBA MDA 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮
需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA 反应有干扰作用。

可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

C （μmol·L -1）=6.45×(A 532－A 600) －0.56×A 450
实验材料与试剂
1．材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。

2．仪器：
分光光度计；冷冻离心机；水浴锅；天平；研钵；剪刀； 5ml 刻度离心管；刻度试管(10ml)；镊子；移液管(5ml 、2ml 、1ml)；冰箱。

3．药品
0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液；5％三氯乙酸溶液：称取5g 三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml ； 0.5％的TBA 溶液：称取0.5g 硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml 。

实验步骤
1．MDA 的提取：取样品0.5g （W ），加入2ml 预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到5ml 刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管+100 C O HN
S N H O O O H H HN
HS N
H O
O HO OH N N H S 2
O
中，最后用缓冲液定容至5ml 。

4500rpm ，4度，离心10min ，上清液即为MDA 提取液，测量提取液的体积（V ）。

2．MDA 含量测定：吸2ml （V2）的提取液于刻度试管中（空白为2ml 缓冲液），加入3ml 0.5％的TBA 溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10 min （自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。

到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。

4500rpm ，4度，离心10min ，取上清液并量其体积（V1）。

上清液于532nm 、600nm 波长下测定吸光度。

3．结果计算:
MDA(nmol·g -1)＝6.452×(A 532－A 600) ×W
V2V 1V ⨯⨯ 式中，V 1为反应液总量（ml ）；V 2为反应液中的提取液数量(ml)；V 为提取液总量（ml ）； W 为植物样品重量(g)。

附四、植物组织中脯氨酸的含量测定
在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline ，Pro ）的含量显著增加。

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。

另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。

在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

实验原理
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm 波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

实验材料与试剂
材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。

仪器：722型分光光度计；研钵；100ml 小烧杯；容量瓶；大试管；普通试管；移液管；注射器；水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀。

试剂： 酸性茚三酮溶液：将1.25g 茚三酮溶于30ml 冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸中，搅拌加
热（70℃）溶解，贮于冰箱中；3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；冰醋酸；甲苯。

实验步骤
1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，
2.0，2.5及
3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。

（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml 离心管中，在3000rpm下离心5min。

（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。

实验结果
根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。

计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。

附五、植物POD酶活力测定
实验原理：
1、过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。

在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。

2、了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。

实验材料、试剂
1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵
2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］
3、实验材料胁迫处理的植物叶片组织
实验步骤
1、粗酶液的提取称取胁迫处理的植物叶片组织材料0.1g，加20mmol/L KH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/L KH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。

2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。

以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。

结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之。

也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。

过氧化物酶活性[u/(g.min)]=
式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。

W——植物鲜重，g。

VT ——提取酶液总体积，mL。

Vs ——测定时取用酶液体积,mL。

t——反应时间，min。