免疫沉淀类试验——免疫比浊
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免疫浊度测定
微生物与免疫教研室
沉淀反应（precipitation）
可溶性抗原与相应抗体在适
当条件下发生特异性结合所出现 的沉淀现象。
分类
液体内沉淀试验 沉 淀 反 应 凝胶内沉淀试验 免疫电泳
絮状沉淀试验 环状沉淀试验
免疫浊度测定 免疫扩散 单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 火箭免疫电泳 对流免疫电泳
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
方法评价
1、敏感度高，可达到ng/L水平 2、操作简单，容易自动化 3、结果稳定、可靠，特异性好；不需 特殊仪器设备，一般分光光度计、自 动化生化分析仪或散射比浊仪均可使 用。
(三)、主要影响因素
1. 抗原抗体比例 2. 抗体的质量 3. 抗原抗体反应的溶液 4. 增浊剂的使用
③结果准确，且能用全自动
③溶液中存在的抗原抗 体复合物分子应足够 大。 ④灵敏度较散射比浊法 低。
2 照射， 碰到溶液中的免疫复合物，对光线产生反射和 折射而形成的。散射浊度法是在入射光的一定 角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与 复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成 复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率 散射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比 浊法(endpoint nephelometry)。
1 透射免疫比浊法
原理：
可溶性抗原抗体在一定缓冲液中发生反应 后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变， 光线通过抗原抗体反应的溶液时，被其中的免 疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下， 免疫复合物量越多，透射光越少，光线被吸收 越多，用吸光度来表示。即吸光度与免疫复合 物量呈正相关。可用抗原标准品建立标准曲线， 测出待检抗原含量。
• 由于免疫复合物颗粒大小再35100nm，对近紫外的光线可见最大 吸收峰，故选择290-410nm波长测 定最佳，目前多用340nm
方法评价：
优点：
①
②
缺点：
①抗体用量较大； ②检测需抗原抗体反应 达到平衡，耗时较长；
灵敏度比单扩法高5— 10倍； 操作简便快速，1h可报 告结果；
化或半全自动化仪器进 行分析，尤其随着胶乳 粒子增强浊度测定法的 出现，使敏感度提高， 其应用更加广泛。
1 抗原抗体比例
1. 高剂量钩状效应（high dose hook
effect ) 2. 海德堡（heidelberger）曲线理论
2 抗体的质量
（1）特异性高
（2）效价高 （3）亲和力高
（4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5 • 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2、散射免疫比浊法 3、免疫胶乳比浊法
通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光 线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物。 通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度 来定量抗原抗体的复合物。 以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微 量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏 度。
3 免疫胶乳比浊法
原理
是一种带载体的免疫比浊法，用抗体致敏的大 小适中，均匀一致的胶乳颗粒（一般是0.2μm）， 在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上抗体与抗原特异 性结合，引起胶乳颗粒凝集。分散的单个胶乳颗 粒直径位于入射光波长之内，光线可透过，当2个 或2个以上胶乳凝集时，则使透过光减弱或散射光 增强。这种减少或增强的程度与胶乳凝集成正比， 与抗原浓度呈正相关。
免疫浊度测定
概念：将现代光学测量仪器与自动化分析 检测系统相结合应用于沉淀反应，可以 对各种液体介质中的微量抗原、抗体和 药物及其他小分子半抗原物质进行定量 测定。
（一）免疫浊度分析的基本原理：
• 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成 小分子免疫复合物(<19S)，在增浊剂(如聚乙 二醇( PEG)、NaF等)的作用下，迅速形成免 疫复合物微粒(>19S)，使反应液出现浊度。 在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫 复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度 亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度 呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同 时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出 标本中抗原的含量
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水剂 • 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
本次实验内容
• 免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测 具体步骤见说明书
思考题
• 免疫浊度测定的原理、方法与分类？ • 影响免疫浊度测定的因素有哪些？
微生物与免疫教研室
沉淀反应（precipitation）
可溶性抗原与相应抗体在适
当条件下发生特异性结合所出现 的沉淀现象。
分类
液体内沉淀试验 沉 淀 反 应 凝胶内沉淀试验 免疫电泳
絮状沉淀试验 环状沉淀试验
免疫浊度测定 免疫扩散 单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 火箭免疫电泳 对流免疫电泳
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
方法评价
1、敏感度高，可达到ng/L水平 2、操作简单，容易自动化 3、结果稳定、可靠，特异性好；不需 特殊仪器设备，一般分光光度计、自 动化生化分析仪或散射比浊仪均可使 用。
(三)、主要影响因素
1. 抗原抗体比例 2. 抗体的质量 3. 抗原抗体反应的溶液 4. 增浊剂的使用
③结果准确，且能用全自动
③溶液中存在的抗原抗 体复合物分子应足够 大。 ④灵敏度较散射比浊法 低。
2 照射， 碰到溶液中的免疫复合物，对光线产生反射和 折射而形成的。散射浊度法是在入射光的一定 角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与 复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成 复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率 散射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比 浊法(endpoint nephelometry)。
1 透射免疫比浊法
原理：
可溶性抗原抗体在一定缓冲液中发生反应 后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变， 光线通过抗原抗体反应的溶液时，被其中的免 疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下， 免疫复合物量越多，透射光越少，光线被吸收 越多，用吸光度来表示。即吸光度与免疫复合 物量呈正相关。可用抗原标准品建立标准曲线， 测出待检抗原含量。
• 由于免疫复合物颗粒大小再35100nm，对近紫外的光线可见最大 吸收峰，故选择290-410nm波长测 定最佳，目前多用340nm
方法评价：
优点：
①
②
缺点：
①抗体用量较大； ②检测需抗原抗体反应 达到平衡，耗时较长；
灵敏度比单扩法高5— 10倍； 操作简便快速，1h可报 告结果；
化或半全自动化仪器进 行分析，尤其随着胶乳 粒子增强浊度测定法的 出现，使敏感度提高， 其应用更加广泛。
1 抗原抗体比例
1. 高剂量钩状效应（high dose hook
effect ) 2. 海德堡（heidelberger）曲线理论
2 抗体的质量
（1）特异性高
（2）效价高 （3）亲和力高
（4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5 • 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2、散射免疫比浊法 3、免疫胶乳比浊法
通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光 线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物。 通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度 来定量抗原抗体的复合物。 以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微 量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏 度。
3 免疫胶乳比浊法
原理
是一种带载体的免疫比浊法，用抗体致敏的大 小适中，均匀一致的胶乳颗粒（一般是0.2μm）， 在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上抗体与抗原特异 性结合，引起胶乳颗粒凝集。分散的单个胶乳颗 粒直径位于入射光波长之内，光线可透过，当2个 或2个以上胶乳凝集时，则使透过光减弱或散射光 增强。这种减少或增强的程度与胶乳凝集成正比， 与抗原浓度呈正相关。
免疫浊度测定
概念：将现代光学测量仪器与自动化分析 检测系统相结合应用于沉淀反应，可以 对各种液体介质中的微量抗原、抗体和 药物及其他小分子半抗原物质进行定量 测定。
（一）免疫浊度分析的基本原理：
• 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成 小分子免疫复合物(<19S)，在增浊剂(如聚乙 二醇( PEG)、NaF等)的作用下，迅速形成免 疫复合物微粒(>19S)，使反应液出现浊度。 在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫 复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度 亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度 呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同 时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出 标本中抗原的含量
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水剂 • 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
本次实验内容
• 免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测 具体步骤见说明书
思考题
• 免疫浊度测定的原理、方法与分类？ • 影响免疫浊度测定的因素有哪些？