生物分离工程教学实习报告终稿

分批培养及其产物分析

一、双水相系统的相图绘制

1.实验目的

了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。

2.实验原理

相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB 称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。

图1 A-B-水双水相体系相图

3.实验器材和试剂

（1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。

（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁

4.操作方法

（1）溶液的配制

配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液

配制40%的聚乙二醇溶液

（2）相图的制作

精确称取一定质量（0.7000g左右）PEG溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG 和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

表1 相图制作表

编号水

/g

(NH4)2SO4溶

液加量/g

纯(NH4)2SO4

累计量/g

溶液累计

总量/g

(NH4)2SO4质

量分数/%

PEG质量

分数/%

1 0.5

2 0.3

3 0.3

4 0.3

5 0.5

6 0.5

7 0.5

根据以上数据以(NH4)2SO4（Mg SO4）质量分数为横坐标，以PEG 质量分数为纵坐标即可做出相图。

二、糖化酶酶液的分批培养

1.实验目的

通过分批培养获得糖化酶发酵液。

2.实验原理

分批发酵又称为分批培养，是指在一个密闭系统内投入有限数量

的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。培养基的量一次性加入，产品一次性收获，是目前广泛采用的一种发酵方式。其优点是:①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较短，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的g数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。

3.实验器材和试剂

（1）器材：红外接种环灭菌器，全温双层摇床。

（2）产酶培养基：蔗糖10.0g，酵母膏20.0g，MgCl2200．0 mg，kH2P04 1.0g，pH值7.0(121℃高压蒸汽灭菌20 min)，定容1000mL.

4.实验步骤

（1）种子液培养：无菌操作将菌种从斜面上接种于LB 培养基中30℃振荡培养（180r/min）12h。

（2）发酵液培养：以5%的接种量接入含100mL培养基的250mL三角瓶中，在30℃恒温摇床上（180r/min）振荡培养72h。

（3）收集发酵液：3000 r/min离心10min，取上清液作为粗提酶液，进行双水相研究。

三、确定双水相的最佳萃取条件

1.实验目的

了解利用和纯化生物活性物质的方法，及其传统溶剂萃取技术异同，加深对分配系数K相比R收率Y等基本概念的认识，掌握双水相萃取的基本实验技术。同时要了解掌握次碘酸盐法测定糖化酶活力的技

术，学习掌握SBA-生物传感器的原理并应用。 2.原理

双水相萃取是利用双水相体系如聚乙二醇（PEG ）/葡聚糖（Dex ）体系，PEG/无机盐等体系的水溶液形成互不相溶的两相，通过选择合适的成相与分配条件，使酶、蛋白质及菌体等生物“大分子”在两相中成不同比例的分配，从而实现酶的提取和纯化。

酶在双水相体系的分配受许多因素的影响，如聚合物种类，分子量及组成，无机盐离子的浓度，pH 值等。分离生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。本实验选用PEG4000/（NH 4）2SO 4双水相体系萃取糖化酶。

表观分配系数

相比

收率

%100%100⨯+=⨯=

b

b t t t t C V C V C V Y 上下相酶总量上相酶总量

纯化因子 F=纯化后比活/纯化前比活 物料衡算

加入的原液总酶活力=上相酶活力×上相体积+下相酶活力×下相体积

式中：C t 、C b 分别为上、下相酶活力（u/mL ）；Vt 、Vb 分别为上、下相的体积（mL ）。

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