磷脂脂肪酸提取

磷脂脂肪酸分析

实验原理：

磷脂脂肪酸是几乎所有活体细胞膜的主要成分，周转速率快且随细胞死亡而迅速降解，脂肪酸结构与种类多样，对环境因素敏感，分析结果重复性较好。

目前已发现的磷脂物质有1000多种。依据极性有强到弱，磷脂可分为磷脂脂肪酸、糖脂脂肪酸和中性脂肪酸。脂肪酸通常被分为6类，直链顺单烯（cis-）、直链反单烯（tran-）、支链饱和、环状及多烯脂肪酸。脂肪酸经甲酯化后形成脂肪酸甲酯（FAMEs），它们又可分为：羟基取代的FAMEs；酯连接羟基取代的FAMEs；非酯连接羟基取代FAMEs；饱和FAMEs；单不饱和FAMEs；酯连接多聚不饱和FAMEs；非酯连接不饱和FAMEs。

仪器及设备

气相色谱、MIDI软件数据库、氮吹仪、固相萃取装置、通风橱、离心机、离心管（Teflon 盖子），试管（Teflon衬垫）、移液管、SPE硅胶柱（6ml），高纯氮气，一次性吸管，水浴锅试剂

柠檬酸缓冲液：柠檬酸3.75g，柠檬酸钠4.41g，用蒸馏水定容至100ml。

甲醇、氯仿、盐酸、丙酮、氢氧化钠、正己烷、甲基叔丁基醚(HPLC级)

试剂1 皂化试剂

氢氧化钠45.0gm

甲醇(HPLC级) 150.0ml

蒸馏水150.0ml

试剂2

甲基化作用试剂:

6N 盐酸325.0ml

甲醇275.0ml

试剂3 抽提溶剂:

正己烷(HPLC级) 200.0ml

甲基特丁醚(HPLC级) 200.0ml

试剂4 洗脱液

氢氧化钠10.80gm

蒸馏水900.00ml

实验步骤：

1、称取2g新鲜土壤于50ml离心管，加入12ml提取液（甲醇:氯仿:柠檬酸缓冲液=2:1:0.8=6.3:3.2:2.5ml）（在加入过程中会有机无机发生分层，建议分别加入），涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡2h，静止10min。

2、室温下5000rpm离心10min，上清转入分液漏斗。

3、再加10ml提取液于离心管（甲醇:氯仿:柠檬酸缓冲液=2:1:0.8=5.3:2.6:2.1ml），涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡30min，静止10min。

4、室温下5000rpm离心10min，上清转入分液漏斗，两次上清合并。

5、分液漏斗中加入氯仿5.8ml和柠檬酸缓冲液5.8ml，振荡1min，静止约1h，将下层转入另一收集管，置于50℃水浴，用氮气吹干。然后再加入2ml氯仿，在50℃水浴中用氮气吹干。样品置于-20℃保存。

6、把硅胶柱放置在固相萃取装置上，用5ml氯仿预洗脱柱子后，用收集管中加3×0.5ml氯仿溶解样品，并转移到SPE萃取，然后分三次加入20ml丙酮，弃掉洗脱液。再分两次加入甲醇12ml，收集含PLFA的洗脱液。在50℃水浴中用氮气吹干。

6、皂化：加入1ml试剂1（NaOH:甲醇:蒸馏水=45g:150ml:150ml）。涡旋振荡5-10秒，盖紧

盖子，置沸水浴中5min，然后振荡5-10s，再置于沸水浴中25min。取出后用自来水冷却。8、甲基化：加入2ml试剂2（6N HCl:甲醇=325ml:275ml），涡旋振荡5-10秒。盖紧盖子于

80±1℃加热保温10±1min。用自来水冷却。

9、萃取：分三次加入9ml试剂3（正己烷:甲基叔丁基醚=200ml:200ml），振荡以提取PLFA

甲酯（振荡时间稍长10min）。用滴管吸取上层正己烷相于另一干净试管，注意不要吸入杂

质层和下层水相。

10、基本洗涤：加入3.0±0.21ml试剂4（NaOH:水=10.8g:900ml），盖紧盖子温和地旋转振荡

试管5min，2000rpm离心3min。转移上层溶液。

11、浓缩收集液至适当体积，将PLFA甲酯转移到自动上样器小瓶。

备注：1）各溶剂沸点：氯仿61.3℃；甲醇64.7℃；正己烷68.7℃；甲基叔丁基醚55.2℃。

2）酯化样品中加入13:0与19:0甲基酯或者16:0与24:0甲基酯作内标。

影响PLFA提取效率的因素：

1）甲醇与土壤比例至关重要

2）缓冲液与相应pH值。如用酸性柠檬酸代替中性磷酸盐缓冲液提取酸性有机质土壤，可提高磷脂回收率且避免无机磷污染；又如，C14-C20 PLFAs在没有其他成分保护时会氧化而迅速降解，提高酸度可延迟酸败。

3）盛放磷脂的玻璃器皿应用10% HCl 浸泡后，于450℃烘4h或400℃过夜去除磷脂污染。4）硅胶应绝对避免与水等强极性介质接触，使用前应在120℃活化2h。

5）整个提取过程应尽量在避光、低温（＜35℃）条件下完成。19:0脂肪酸甲醋为内标,在甲基化之前加入

表1表征微生物的PLFA：

微生物类型磷脂脂肪酸标记

细菌含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸（如15:0、i15:0、a15:0、16:0、i16:0、16:1ω5、16:1ω9、16:1ω7t、17:0、i17:0、a17:0、cy17:0、

18:1ω5、18:1ω7、18:1ω7t、i19:0、a19:0、cy19:0）革兰氏阳性菌含有多种分枝脂肪酸

革兰氏阴性菌含有多种羟基脂肪酸

厌氧细菌cy17:0、cy19:0、

好氧细菌16:1ω7、16:1ω7t、18:1ω7t

硫酸盐还原细菌10Me16:0、i17:1ω7、17:1ω6

甲烷氧化菌16:1ω8c、16:1ω8t、16:1ω5c、18:1ω8c、18:18t、18:1ω6c

嗜压/嗜冷细菌20:5、20:6

黄杆菌i17:1ω7

芽孢杆菌各种支链脂肪酸

放线菌10Me16:0、10Me17:0、10Me18:0等

真菌含有特有的磷脂脂肪酸（18:1ω9、18:2ω6、、18:3ω6、18:3ω3）

蓝细菌含有多不饱和脂肪酸（如18:2ω6）

微藻类16:3ω3

原生动物20:3ω6、20:4ω6

脱硫细菌cy18:0（ω7,8）

硫细菌i17:1ω5、10Me18: 1ω6、11Me18:1ω6

脱硫弧菌i17:1ω7c、i15:1ω7c、i19:1ω7c

脱硫叶菌17:1ω6、15:1