01第一章_生物大分子物质的制备

第三节 细胞的破碎
细胞是生物体结构和功能的基本单位。
有效成分可以分泌于细胞外，也有存在于细胞内的。 如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培养液中，用 适当的溶剂可直接提取。
存在于细胞内的酶又有游离酶和结合酶之分，前者游 离在细胞质中，后者则与细胞器紧密结合(如氧化还 原酶和有机磷水解酶等)。
欲提取存在于细胞内的物质时，必须把细胞破碎（个 别的则例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。 动物脏器的细胞膜比较脆弱，极易破损，往往在组织 绞碎或提取时就被破坏了。 植物和微生物的细胞壁较牢固，需要在提取前进行专 门的破细胞操作。
4 免疫分析法 采用抗体与抗原之间发生的特异反应，并结合放射性 同位素标记或酶标记，就可对有关物质进行灵敏的定 性或(和)定量分析(详见第十九章)。
5 生物传感器
用生物传感器中的敏感膜（具有分子识别功能的生物 活性材料如酶、蛋白、抗体、生物膜和微生物等作为 敏感元件）与待测溶液中的某一物质进行反应，即可 通过显示器反映出有效成分的数量(详见第十七章)。
C.材料选择应遵循的原则 有效成分含量多、稳定性好 来源丰富、保持新鲜 提取工艺简单
有综合利用价值等
二、材料的处理
选择到合适的材料后，应及时使用，或采用冰冻 或干燥等方法处理。
同时还应将易于去掉的非需物质除去。
1 动物脏器
(1)冰冻
应在很短时间内置-10℃冰库(可短期保存)或-70℃低 温冰箱(数月不变质)贮存。 脱脂 脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯 化操作和制品得率。 一般脱脂的方法有： A.人工剥去脏器外的脂肪组织； B.浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂； C.采用快速加热(50℃左右)、快速冷却的方法，使熔化 的油滴冷却后凝聚成油块而被除去； D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。
白质或酚类等物质。
B.测定蛋白质的含量及纯度 蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质 组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱 氨酸的贡献很小。
②比色法 将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表 1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产 物特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的 消光值换算出待测物的含量。 例如： 邻苯二酚(在275nm有吸收峰) + 邻苯二酚-2,3-双加氧酶 黄色的α- 羟基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰) 通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活 力。
第二节 确立测定方法
一、目的与要求
测定哪些材料含有目标有效成分？ 哪些材料含量丰富？ 提纯过程纯度是否逐渐增加？ 要确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。 因为：有效成分在原材料中含量较低；底物要专一 性的。
二、常用的测定方法
1.光谱法 2.电化学法 3.生物活性检测法 4.免疫分析法 5.生物传感器
1 光谱法 (1)吸收光谱法[①直接测定法；②比色法] (2)荧光法 (3)浊度法
特点： 测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消 光值； 且操作简单，反应迅速、灵敏； 结果也较准确，
(1)吸收光谱法 直接测定法、比色法 ①直接测定法 将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后， 移至相应波长的分光光度计中， 即可从测定的消光值换算出待测物的含量。
一、机械破碎 1 研磨法 剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研碎。 用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎。 大规模生产时，可用电动研磨法。 细菌和组织的细胞破碎均可用此法。 2 组织捣碎器法 这是一种剧烈的破碎细胞方法。 捣碎器(8 000~10000r/min)处理30~45s，植物和 动物细胞能完全破碎。
4 温度 一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定。 但有些物质对温度的要求却与此不同。 例如： 从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶对低温敏感，25℃时才 稳定。 有机磷农药水解酶，置-10 ℃时会快速失活，移至21℃ 时两天后开始失活，此后每天失活剩余酶的16％。若 将其存放在6℃时失活速度较缓慢，每天约丧失活力 0.75％。
2 溶剂的极性和离子强度 有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定； 有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 （1）通常降低极性的方法 在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度。 若用二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺代替蔗糖或 甘油时，会使溶液的极性大大降低。 （2）离子强度等于溶液中各离子浓度（C）与离子电 荷数（Z）平方乘积总和的二分之一。 在水溶液中加人中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和 (NH4)2SO4能提高溶液的离子强度。 一般来说： 离子强度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解，保护 蛋白质活性的作用； 离子强度过高则会引起蛋白质发生盐析作用。
7 金属离子 蛋白质的巯基能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生 沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的 试剂中。 解决的办法: ①用无离子水或重蒸水配制试剂； ②在配制的试剂中加入1-3mmol／L EDTA(金属离子络 合剂)。
(2)干燥
A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用； B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。
2 植物组织
A.叶片 用水洗净即可使用； 或在l0h内置-4～-30℃冰箱贮藏备用。 B.植物种子 需泡胀或粉碎才可使用。 材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。
3 微生物
为制备生命大分子物质的主要材料之一。 用离心法收集到的上清液， 可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分； 可置低温下短时间贮存。 收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有 效成分； 或制成冻干粉，在4℃保存(数月不会变质)。
例子：
谷草转氨酶(GOT)活力测定 采用与苹果酸脱氢酶（MDH)相偶联反应进行。 天冬氨酸 +α- 酮戊二酸 GOT 草酰乙酸 + 谷氨酸 草酰乙酸 +
+ MDH NADH+H
L - 苹果酸+NAD+
每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH，这样GOT活 力就可通过测定NADH在340nm消光值的下降来求得。
二、抽提有效成分的影响因子
抽提时 pH值、金属离子、溶剂的浓度、极性等因子， 可明显影响有效成分的性质和数量。
1 pH值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般 选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。 通常： 抽提碱性蛋白质选用低pH值的溶液； 抽提酸性蛋白质选用高pH值的溶液； 或者用调至一定pH值的有机溶剂。
3 水解酶 在抽提、纯化蛋白质或核酸时，其效果常常受到本身 存在的水解酶的影响。 这些酶在与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件 适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使 实验失败。
防止方法（目的是使这些酶丧失活性 ）：
①加入抑制剂(苯甲基磺酰氟化物，PMSF，见表1-3、14)， ②调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，
第一章 生命大分子物质的制备
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 材料的选择与处理 确立测定方法 细胞的破碎 抽 提 浓 缩 纯化方案的设计与评价 有效成分纯度和性质的分析 应用实例
生命大分子物质通常是指： 动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白 质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。 生命科学研究将进入后基因组时代。分离纯化和 测试分析蛋白质技术显得十分重要。 本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般 过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效 成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(这部分移至 后面的章节介绍)等步骤。
第四节 抽 提
一、抽提的含义
抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效 成分分离出来的过程。 经过处理和破细胞原材料中的有效成分可用 缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂(如丙酮、乙醇)等
抽提；还可用蒸馏水抽提。
一般理想的抽提溶液应具备下述条件： 对有效成分溶解度大，破坏作用小； 对杂质不溶解或溶解度很小； 来源广泛、价格低廉、操作安全等。
5 搅拌 搅拌可促使欲抽提物与抽提液之间相互接触，并能增 加溶解度。 但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易 产生泡沫，导致某些酶类变性失活。
6 氧化 存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子 间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。 在抽提液中加入还原剂时，就可以防止巯基发生氧化 作用，或者延缓某些酶活性的丧失。 在有些植物组织或微生物细胞中含有较多的酚类化合 物，加入还原剂可防止褐化。
还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度 例如 纯细胞色素c还原型A550／氧化型A280比值为1.25~ 1.28。 假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂 质。
(2)荧光法 特点： 荧光法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。 当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光 法却能求得满意结果。 如： NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（辅酶Ⅰ） NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（辅酶Ⅱ） 由于NADH2和NADPH2发荧光，用于偶联NADH2 (或 NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的还原反应系统进行 荧光测定。
二、溶胀和自溶 1 溶胀 细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐 溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。 2 自溶 细胞结构在本身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯 酶等)作用下，发生溶解的现象称自溶。
三、化学处理 脂溶性的溶剂可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解 四、生物酶降解 生物酶来自百度文库如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。 在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而 来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞 完全破碎。
3 生物活性检测法
大多数生命物质，尤其是一些激素类物质，当把它们 注射入动物的特定器官时，所属机体将发生相应的变 化，并且二者间有一定的相关性。根据这一性质设计 的方法，即可对生命活性物质进行检测。 如：在某个动物器官中注射某种激素，使器官细胞 加速分裂，通过检测细胞的数量变化来推测激素的生 物活性。
(3)浊度法 极稀的悬浮液可采用此法测定，即测定悬浮液在不被 吸收的波长下表观的消光值。 例如 伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力测定方法 之一就是采用此法(A420)。 培养液中细菌生长的浓度(A600) 也可用此法测定。
2 电化学法 有些反应过程会放出质子氢(H+)，可用灵敏的pH计或 NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测 物的含量或活力。 例如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸， 用NaOH溶液滴定该酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶 的活力。
3 超声波法 它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方 法。 4 压榨法 此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。 用1.77×108～3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬 液通过一个小孔(<细胞直径的孔)，致使其被挤破、压 碎。
5 冻融法 将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或 40℃左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在 形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、 破碎。
A.测定核酸含量 构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依 据。 在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低， 会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低， 二者之间成正比关系。
通常1个A260值分别相当于 双链DNA 50µ g／ml 单链DNA 37µ g／ml 单链RNA 40µ g／ml 用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度： 纯DNA比值为1.8 纯RNA的比值为2.0 当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋
第一节 材料的选择与处理
一、材料的选择
A.有效成分
是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成 分以外的其他物质则统称杂质。


B.有效成分在材料中存在的特点 有效成分的含量一般较少 如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。 有效成分稳定性较差 大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏 感，易被微生物分解变质。 选用的材料不同，有效成分的含量就不同； 选用的材料即使相同，但是部位或生长期不同，有效 成分的含量也不尽相同。