第三章 抗体的制备与纯化技术
抗体的检测和纯化课件
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• Protein A
• A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
•
Protein A--Sepharose CL24B 亲和层析法
的原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地
结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合
力,结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b >
IgG3 > IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p
H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯
化与其结合较弱的IgG1。
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方法
1 腹水的处理 取腹水,在4 ℃,12 000g 条件下 离心15min ,以除去较大的凝块。
2 装柱 将1. 5g Protein A-Sep harose CL-4B 干 粉用6～7ml 三蒸水溶解,再用0. 02M ,p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然 后装入层析柱中。
一 饱和硫酸铵沉淀法
•
饱和硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋
白质的常用方法。这是一种比较原始，非
特异性分离技术。
•
饱和硫酸氨沉淀法难以得到高纯度
抗体制备方法
第1章 抗体制备技术抗体（antibody，Ab）是机体B淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。
机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。
由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。
在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。
本章主要介绍这两种抗体的制备方法。
实验一 多克隆抗体的制备多克隆抗体（polyclonal antibody）是机体针对抗原的不同表位所产生的抗体混合物。
是用制备的纯化免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，在含有多种抗原表位的抗原刺激下，该动物体内多个B细胞克隆被激活并产生针对这种抗原多种不同表位的抗体混合物。
含有这些特异性抗体的动物血清称为免疫血清或抗血清，而从免疫血清中纯化的免疫球蛋白则称为抗体。
一、抗体制备的流程优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。
因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。
（一）免疫动物的选择免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。
选择动物要依据抗体制备的条件而定。
1．抗原与动物的种系 抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。
如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较近的鸭或鹅，则免疫原性较差。
2．动物的个体状况 动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。
基因工程制备抗体方案有哪些
基因工程制备抗体方案有哪些引言抗体是一种可以识别并结合特定抗原的蛋白质，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
传统制备抗体的方法主要是从动物（如小鼠、兔子等）中提取抗体，但该方法存在一些缺点，如周期长、成本高、质量不稳定等。
因此，基因工程技术的发展使得制备抗体的方法得到了革命性的改变，可以通过基因工程技术在体外合成抗体，提高了抗体的质量和稳定性。
本文将介绍基因工程制备抗体的方法和流程，包括抗体的选择和克隆、表达、纯化和鉴定等环节。
通过基因工程方法获得的抗体，可以应用于药物研发、医学诊断、生物学研究等领域，具有广阔的应用前景。
1. 抗体的选择和克隆（1）抗原的选择制备抗体的第一步是选择合适的抗原。
抗原是引发免疫反应的物质，可以是蛋白质、多肽、多糖、药物等。
根据需要制备的抗体类型，可以选择相应的抗原。
例如，如果需要制备单克隆抗体，可选择单个抗原蛋白作为抗原进行制备。
（2）抗体基因的克隆在选择了合适的抗原后，下一步是将抗体基因克隆到表达载体中。
通常可以利用PCR方法从免疫细胞中扩增出抗体基因，并将其插入表达载体中。
选择合适的表达载体是非常重要的，通常选择在哺乳动物细胞或大肠杆菌中表达。
2. 抗体的表达（1）表达载体的构建在决定抗体表达载体后，接下来是进行表达载体的构建。
通常表达载体包括启动子、终止子、选择标记基因等，通过合成或限制性内切酶切割等方法将抗体基因插入表达载体中。
（2）转染和筛选将构建好的表达载体导入宿主细胞中，可以通过转染等方法实现。
转染后，需要进行筛选，筛选出表达抗体的稳定细胞株。
通常可以利用克隆技术选取高表达的细胞株。
3. 抗体的纯化（1）细胞培养和收获经过筛选的稳定细胞株可以进行大规模培养，收获细胞培养上清液。
（2）亲和层析纯化常用的抗体纯化方法包括亲和层析纯化。
可以利用蛋白A/G或其他具有特异性结合抗体的配体进行纯化。
通过这种方法可以高效地将目标抗体从细胞培养上清液中纯化出来。
4. 抗体的鉴定（1）免疫印迹（Western blot）通过Western blot方法，可以验证纯化得到的抗体是否具有结构完整，是否与目标抗原结合。
第03章抗体制备
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
抗体纯化技术
抗体纯化技术抗体纯化技术是生物技术领域中应用最广泛的技术之一。
它是利用分子特异性相互作用，将杂质分离排除，从而获得纯度高、活性好、病原体清除率高的抗体制备过程的一种技术。
抗体纯化技术广泛应用于药物研发、分子诊断、分子生物学实验、生物检测等领域。
本文将从抗体的制备、分离、纯化三个角度，分别介绍抗体纯化技术的原理及其常用的纯化方法。
一、抗体的制备抗体的制备可以通过两种方式：1、动物免疫法；2、体外合成法。
动物免疫法是指通过注射一定量的抗原，在动物身上诱导其产生抗体，并从动物的血清中提取抗体。
体外合成法是利用原位合成策略，在细胞话表达体系或酵母菌上表达人工合成的抗体，再通过对产物的纯化和反应性测定，获得抗体制备。
二、抗体的分离抗体的分离需要依托一些特异性官能团与抗体的结合作用，如离子交换、亲和层流、凝胶过滤、凝胶电泳、超滤等。
其中，离子交换和亲和层流是目前用的最广泛的方法之一，可快速、高效地达到抗体分离的目的。
1、离子交换：离子交换是指利用固定在某种阵列上的一种或多种离子交换基团，以官能基团与抗体的分子手性的作用进行分离。
该方法分为阳离子交换和阴离子交换，它利用离子交换层的低份子量来固定和选择性地分离抗体及其杂质。
2、亲和层流：层流法是根据不同抗体的特异性分离的一种方法，抗体与特定抗原结合后，可采用层流法对其进行分离。
该方法分为亲和层流和亲合层流两种类型，前者是指利用抗体与其特定抗原之间的特异性，通过抗原固定在材料上，进行互补反应，以分离有治疗功效或有用的抗体；后者则是指利用抗体与其一些非特定抗原结合的作用，来对所有的抗体进行纯化，比如利用蛋白A的亲和性提取IgG。
三、抗体的纯化抗体的纯化主要包括离子交换、亲和层流、凝胶过滤、凝胶电泳、超滤等。
在这些纯化方法中，离子交换、亲和层流、凝胶过滤被广泛应用于抗体纯化中。
1、离子交换：融合相对较低的离子浓度和相对较强的取向共价键作用，利用离子交换基团将抗体和杂质分离。
临床免疫学检验-课件-第3章-抗体制备
4.表面活性剂处理
• 原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。
• 常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。
• 应用：①破碎细菌，且作用比较温和； ②提取核酸时，常用此法破碎细胞。
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌细胞抗原的制备流程图
O菌体抗原
• 免疫方法：颗粒性抗原呈乳浊状，
多用静脉内免疫， 较少用佐剂作皮内注射。
二、可溶性抗原制备及鉴定
•可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸
•来源: 组织和细胞，其成分比较复杂。
– 等密度梯度离心（Isopycnic gradient Centrifugation）常用于分离密度不同的组分。
离心方法的选择
方法
离心特点
分离效果
适用范围
差速离心
短时间、多次用 不同速度和时 间离心。
粗分离，纯度和效率不 高。
分子量相差大、不稳定、 易变性的物质。常 用于分离细胞器和 病毒。
密度梯度离心
一、颗粒性免疫原（细胞抗 原、细菌抗原）的制备 二、可溶性抗原制备 三、半抗原
一、颗粒性免疫原的制备
NS稀释至 2～5%
摇动
15-20min
可
4℃
保
存
3
周
NS洗涤3次 2000r/min
10min
取适量
绵羊红细胞的制备流程图
组织细胞悬液的制备流程图
肾、肺 → 剪碎、洗涤、离心 → 胰酶消化 → 单个细胞
抗体的制备实验报告
抗体的制备实验报告抗体的制备实验报告引言：抗体是生物学研究中不可或缺的工具，它能够识别和结合特定的抗原分子，从而发挥免疫应答的作用。
本实验旨在通过制备抗体的过程，了解抗体的结构和功能，并探讨其在生物医学领域中的应用。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 抗原：选择合适的抗原，如蛋白质或多肽。
- 动物模型：选择适合的动物模型，如小鼠或兔子。
- 细胞培养基：提供细胞生长所需的营养物质和环境。
- 抗体检测试剂盒：用于检测抗体的产生和效力。
2. 实验方法：- 抗原注射：将抗原注射到动物体内，刺激其免疫系统产生抗体。
- 血清采集：采集动物的血清样本，含有抗体。
- 抗体纯化：利用蛋白质纯化技术，从血清中分离和纯化抗体。
- 抗体检测：使用抗体检测试剂盒，检测抗体的产生和效力。
结果与讨论：通过实验，我们成功制备了抗体，并进行了相关的检测。
在实验过程中，我们发现以下几个关键点：1. 抗原的选择：在制备抗体的过程中，选择合适的抗原至关重要。
抗原应具有较高的免疫原性，能够有效刺激免疫系统产生抗体。
同时，抗原的纯度和稳定性也需要考虑，以确保抗体的质量和效力。
2. 动物模型的选择：不同的动物模型对抗原的免疫反应有差异。
在实验中，我们选择了小鼠作为动物模型，因其免疫系统对抗原的应答较为敏感。
然而，不同的研究目的可能需要选择不同的动物模型，以获得更准确的实验结果。
3. 抗体的纯化：通过蛋白质纯化技术，我们成功地从血清中分离和纯化了抗体。
抗体的纯化可以去除其他血清成分的干扰，提高抗体的纯度和效力。
纯化后的抗体可用于进一步的实验研究或生物医学应用。
4. 抗体的检测：我们使用抗体检测试剂盒对制备的抗体进行了检测。
抗体检测可以评估抗体的产生和效力，并验证其对特定抗原的结合能力。
合格的抗体应具有较高的结合亲和力和特异性，以确保其在实验和临床应用中的可靠性。
结论：通过本实验，我们成功制备了抗体，并验证了其在生物医学研究中的重要性和应用潜力。
抗体的提取与纯化
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
2置4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
3 置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
4 末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02mol/L pH7.4 PBS溶解至xml装入透析袋。
对PBS 充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
见表2-5。
从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。
抗体的分离纯化原理和测定优秀课件
•
硫酸铵浓溶液的pH常在4.5—5.5之间，市售
的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5
以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。
(三)盐析时需注意的问题
• 1. 盐的饱和度
• 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的主要因素， 不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离 几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由低 到高逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离 心分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种 蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白， 当饱和度达20％时，纤维蛋白原首先析出；饱 和度增至28％—33％时，优球蛋白析出；饱和 度达33％—50％时，球蛋白析出；饱和度大于 50％以上时，清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱 和皮为33％开始析出。
• 可依据抗体的特性进行分离纯化： 据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法
将抗体与其他蛋白分开；据抗体带有电荷 的不同，用离子交换，电泳等技术分离….. 按分离方法： 沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其 中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离 即纯化。
一、盐析法
• （一）原理
•
蛋白质的溶解度在一定范围内随盐的浓度变
抗体的分离纯化原 理和测定
第一节 抗体的分离纯化
• 无论是将抗体用于研究还是用于检测 或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。
• 分离：将抗体从其存在的体液或培养液 中分离出来并加以初步纯化。
• 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并 将其中的杂质控制在所需的低水平。对治 疗性抗体尤为重要。
分离纯化的方法
• 2．截留分子量
•
超滤膜的另一基本性能是标称截留分子量。
它的定义是指溶液中被截留的溶质中最小的分子
量。对于“截留分子量”这个指标，不应做机械
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
蛋白纯化及抗体制备方法
蛋白表达及抗体制备流程图具体实验步骤（一）蛋白原核表达载体的构建蛋白原核表达载体一般带有His or GST 接头。
构建载体时要确保读码框的正确。
（二）重组质粒转入蛋白表达菌株BL21 or ER2566转化方法同常规转化。
（三）转化菌株的小量诱导表达(1) 从转化的平板中挑取单菌落，接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；（2）取100μl过夜培养的菌液接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振达到0.6-0.8；荡培养50min左右，使 OD600(3) 加入IPTG至0.5mM，37℃诱导培养4 h；(注意设置不加IPTG的对照；一般诱导条件为37℃诱导培养4 h，但根据蛋白的不同，诱导温度和时间会有所不同)；(4) 取1mL菌液，12000rpm离心10min，收集菌体；(5) 用100μL PBS悬浮菌体菌体，加入20μL 6×SDS凝胶加样缓冲液，100℃沸水浴10 min；(6) 12000rpm离心10 min，取菌体裂解液上清进行SDS-PAGE。
（if经诱导的菌株有目的蛋白表达，则继续如下操作）（7）以相同条件诱导并收集菌体（方法见1-4）；（8）加入200μL PBS悬浮菌体；（9）将浑浊的菌体悬浮液超声至变清(注意冰上操作)；（10）12000rpm离心10min，取上清至另一干净EP管，即为上清管（11）余下沉淀用100μL PBS悬浮，即为沉淀管（包涵体）；（12）分别向上清管和沉淀管中加入6×SDS凝胶加样缓冲液，100℃沸水浴10 min；（13）12000rpm离心10 min，取上清管和沉淀管的上清进行SDS-PAGE。
（if蛋白在上清或沉淀中有特异表达，则继续进行大量诱导表达）（四）转化菌株的大量诱导表达(1) 挑取单菌落于5 mL含Amp的 LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；达0.6-1.5左右（一(2) 按1：1000的比例转接扩大培养，37℃振荡培养至OD600般250mL LB中加入5mL菌液，培养1h50min左右；最好摇500mL，以便有足够的样品做后续实验）(3) 加入IPTG至0.5 mM，37 ℃诱导4h（一般诱导条件同小量诱导；但根据蛋白不同，有的诱导条件会有所不同。
抗体制备流程
抗体制备流程一、背景介绍抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于生命科学领域。
抗体制备是指从动物血清或单克隆细胞中提取纯化抗体的过程。
本文将介绍抗体制备的详细流程。
二、材料准备1. 动物：常用小鼠、大鼠、兔子等；2. 抗原：根据实验需要选择适当的抗原；3. 组织破碎液：可以使用高渗盐溶液、甘油等；4. 纯化柱：可以使用蛋白A/G，蛋白L等；5. 色谱柱：可以使用离子交换柱、大小分离柱等。
三、抗原制备1. 合成或提取目标分子作为抗原；2. 重组表达目标分子作为抗原；3. 从组织或细胞中提取目标分子作为抗原。
四、动物免疫1. 免疫前处理：（1）对动物进行基础检查，确保健康状态良好；（2）按照实验需要确定免疫计划，如免疫次数、免疫间隔等；（3）根据实验需要选择适当的免疫方式，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 免疫过程：（1）将抗原与佐剂混合后注射到动物体内；（2）在免疫后的一定时间内采集血清；（3）根据实验需要重复进行免疫。
五、抗体检测1. 间接ELISA法：将抗原固定于微孔板上，加入动物血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
2. Western blotting法：将蛋白质分离并转移至膜上，然后加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
3. 免疫组化法：将组织切片或细胞涂片固定并处理后，加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
六、抗体纯化1. 亲和层析法：利用特异性结合亲和剂纯化目标抗体，如蛋白A/G、蛋白L等；2. 离子交换层析法：利用抗体表面带电性质与离子交换树脂上的离子进行吸附和洗脱；3. 大小分离层析法：利用抗体的分子量差异与分子筛或凝胶过滤树脂进行分离。
七、抗体保存1. 冷冻保存：将纯化后的抗体溶液加入甘油后冷冻保存在-20℃或-80℃；2. 溶液保存：将纯化后的抗体溶液加入保护剂后在4℃下保存。
八、总结以上就是抗体制备的详细流程，其中包括了材料准备、抗原制备、动物免疫、抗体检测、抗体纯化和抗体保存等步骤。
第3章免疫原和抗血清的制备
二、免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 特异性要求高，应小量短程，可溶性抗原加用佐剂。对效价 要求高，则可大量长程加佐剂。
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
使包膜的渗透压改变而溶解。
优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)
3、免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
IgG片段的制备
1.酶裂解法：
IgG
木瓜酶
Fc+2Fab
Fc段可用于制备抗重链血清。
透析除去未反应
的半抗原
得人工免疫原 （半抗原+载体）
2.戊二醛法：
半抗 原氨 基
N-CH-(CH2)3-CH-N
载体 氨基
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
小结
免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的 物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质， 与载体结合后可具有免疫原性。
抗体的制备与使用指南
抗体的制备与使用指南一、抗体的制备。
1. 免疫原的选择。
- 对于制备抗体，首先要确定合适的免疫原。
如果是针对蛋白质抗原，要保证其纯度尽可能高。
例如，从细胞裂解物中纯化目标蛋白，可以采用亲和层析等方法。
对于小分子半抗原（如药物分子等），通常需要将其与大分子载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联，以增强其免疫原性。
- 免疫原的剂量也很关键。
一般来说，初次免疫时，对于小鼠等小动物，蛋白质抗原的剂量可在10 - 100μg之间，具体剂量需要根据抗原的性质和动物的种类进行优化。
2. 动物的选择与免疫。
- 动物选择。
- 常用的动物有小鼠、大鼠、兔子等。
小鼠因为繁殖快、成本低，是实验室制备单克隆抗体时常用的动物。
兔子则常用于制备多克隆抗体，其血清中抗体产量相对较高。
- 免疫程序。
- 对于小鼠，初次免疫可采用皮下注射或腹腔注射的方式。
以皮下注射为例，可在小鼠背部多点注射免疫原。
初次免疫后，间隔2 - 4周进行加强免疫，加强免疫的剂量可以适当减少，一般为初次免疫剂量的1/2 - 1/3。
经过2 - 3次加强免疫后，可检测动物血清中的抗体效价。
3. 单克隆抗体的制备。
- 细胞融合。
- 在小鼠免疫后，取其脾脏细胞（其中含有产生抗体的B淋巴细胞），与骨髓瘤细胞（如SP2/0细胞系）在聚乙二醇（PEG）的作用下进行融合。
融合后的细胞具有两种细胞的特性，既能产生特异性抗体，又能在体外无限增殖。
- 筛选阳性克隆。
- 利用次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型的骨髓瘤细胞和HAT （次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶核苷）选择培养基进行筛选。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因为缺乏HGPRT酶而死亡，未融合的脾细胞在体外不能长期存活，只有融合成功的杂交瘤细胞能够生长。
然后通过ELISA等方法筛选出产生特异性抗体的阳性克隆。
- 克隆化培养。
- 对筛选出的阳性克隆进行克隆化培养，常用的方法有限稀释法和软琼脂平板法。
限稀释法是将细胞悬液进行连续稀释，使每个孔中理论上只含有一个细胞，然后培养这些细胞，形成单克隆的细胞集落，从而得到稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞系。
抗体的制备与纯化技术
2）克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 克隆化的方法主要有：有限稀释法、单个细胞显微操作法、软琼脂培养法
融合后细胞在HAT培养基[次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基]中存活情况（脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。） 脾细胞（ HGPRT+, TK+, 不能长期生长） 骨髓瘤细胞（ HGPRT-, TK-，不能生长 ） 杂交瘤细胞（ HGPRT+, TK+ ，能够生长）
一、抗原制备
可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。 （1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。 超声破碎：一次超声1～2min，总时间为10～15min。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
详细介绍抗体的分离纯化
步骤如下: 1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v); 2.在4度搅拌4小时; 3.17,000g离心; 4.丢弃沉淀; 5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;
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7
苯酚红
苯酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是苯酚红可能结合 到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去。苯酚红能够在pH>7时结合在阳离子柱上。
任何离子通过柱时的
移动速率取决于与离 子交换剂的亲和力、 电离程度和溶液中各 种竞争性离子的性质 和浓度。
离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂 的玻璃管（1.5 cm×15 cm）中进行的。 24
透析法 超滤法 葡聚糖凝胶G50层析法。
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第三节 离子交换层析法
离子交换层析法（ion exchange chromatography， IEC） 是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结
合力的差别，而进行分离的一种技术。
广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。
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沉淀剂
可用于高脂蛋白的样品,例如腹水
沉淀脂蛋白
可能会不可逆的使蛋白变 性,适合于小肽 的制备或 者制备电泳样品 沉淀聚集的核酸蛋白 沉淀聚集的核酸蛋白 沉淀核酸 沉淀血清或者腹水中的大 量蛋白,仅把免
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0.1% (w/v) 1% (w/v) 1% (w/v) 1:15 (w/w) 抗体含量应该大于 1mg/ml
注意： • 对于少量的样品或者蛋白能吸附在滤膜上，可以用10000×g离心15分钟。 • 对于细胞样品，可以在40000到50000×g离心15分钟，若样品需要短处理时间，可以减少到10到 15分钟。 • 离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。 • 血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。
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第二篇 分子免疫学技术授课内容
一、特异性抗体的制备与纯化技术 二、蛋白质研究水平的分子免疫学技术 三、DNA研究水平的分子免疫学技术 四、基因组和蛋白质组研究水平的分子免疫学技术
授课方式：讲授、自学、演示相结合
第三章 特异性抗体的制备与纯化 技术
绪论
特异性抗体： 多克隆抗体（抗血清） 单克隆抗体（杂交瘤技术） 基因工程抗体
⑦ 其它
聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白
可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨后直接 用以动物免疫。
NC膜结合蛋白
将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜 上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目的条带置于加有 PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至无色，继而剪碎、研磨， 用于动物免疫。
三 杂交瘤技术的原理 1.亲本细胞的选择 小鼠骨髓瘤细胞 次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT) 缺陷型 免疫脾细胞 经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏
（抗原制备方法同多克隆抗体制备方法）
BALB/c小鼠简介
1913年，贝格(Bagg)从美国商人欧希尔(Ohio)处购得的白化小鼠原种， 以群内方法繁殖。麦克· 多威尔(MacDowell)在1923年开始作近交系培育 ，至1932年达26代，命名为BALB/c品系。安德尔文特(Andervont)等人 使BALB/c广为传播和应用。1985年我国从美国NIH引进到中国医学科 学院实验动物研究所，为BALB/c第180代。 毛色：白化。 主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病 率高;卵巢、肾上腺和肺的肿瘤在该小鼠有一定的发生率。②易患慢性 肺炎。③对放射线甚为敏感。④与其他近交系相比，肝、脾与体重的比 值较大。20月龄的雄鼠脾脏有淀粉样变。⑤有自发高血压症，老年鼠心 脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。⑥对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻 疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因 子敏感。 主要用途：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以 及单克隆抗体的制备等。
2）可溶性抗原
可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、 酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞， 成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然 后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴 定后才能用做免疫原。 （1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保 存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以 及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加 入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常 用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和 酶处理法等。 超声破碎：一次超声1～2min，总时间为10～15min。
（4）纯化抗原的鉴定
含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法， 一般采用分光光度计测量法； 相对分子量的鉴定：一般采用SDS-PAGE电 泳法； 纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。
3）半抗原
半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、 多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药 物及其它化学药品； 常用载体：蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清 蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys 大分子聚合物：如羟甲基纤维素； 半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法，物 理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微 孔吸附半抗原，化学法则是利用某些功能基团把半 抗原连接到载体上。
2、免疫方法
剂量：合适，太大，易引起免疫耐受 途径：多用皮内或皮下多点注射（足掌、 背部两侧） 腋窝淋巴结直接注射 静脉、腹腔注射 间隔时间：第一次免疫（完全佐剂） 10-20天 第二次免疫（不完全佐剂） 7-10天 第三次， 总次数5-8次。
3、免疫血清采集、分离及保存
1）采血前测抗体效价 在第2次加强免疫后2周，从兔耳缘静脉取2～ 3ml血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期 效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗 体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。 抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含 量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对 所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗 原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者 测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。
2）特异性IgG类抗体的纯化
硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用2 次33%饱和度沉淀丙种球蛋白。 离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素 和QAE纤维素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附 血清中多种蛋白质，但不能吸附IgG. 亲和层析法：将纯抗原（或SPA)交联到 Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱， 特异性吸附IgG。 凝胶过滤法：分子筛层析
2）抗血清的采集、分离和保存
采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血 分离：室温自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱 过夜，待血块收缩后分离血清，有些血清须 经56℃30min 使补体灭活。 保存：4℃保存—存放3个月至半年 低温保存—2至3年，忌反复冻融 冰冻干燥—4-5年
3）免疫失败的可能原因及应采取的措施
3）常用佐剂的种类和制备
应用最多的是福氏佐剂和细胞因子佐剂 福氏佐剂： 不完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂 完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂+卡介苗 福氏佐剂：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液（乳 化方法主要有研磨法和注射器混合法）。 完全佐剂一般不连续2次使用 细胞因子佐剂 IL-2 IL-1 IFNr CSF等
双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两 者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体 及其浓度。 琼脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g 的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用 纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠 （NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼 脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝 固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为 50μ l），周围各孔内分别加入50μ l 1：2、1：4、1：8、 1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观 察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。
3、抗体鉴定
抗体效价的鉴定；如双向扩散等 抗体特异性鉴定：用交叉反应率来表示； 抗体纯度鉴定：可用PAGE电泳或SDS-PAGE电泳 鉴定； 抗体亲和力鉴定：抗体亲和力是指抗原、抗体结合 牢固的程度。亲和力越大表示抗体与相应抗原结合 越牢固。抗体亲和力大小常以亲和常数K表示，K 的单位是升/摩尔。在RIA（放射免疫技术）测定时， K是该抗血清能达到的最小检出量的倒数。K的范 围在108～1012L/mol之间。
（3）蛋白提纯
① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl； ② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特 性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成 分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的硫酸 胺收集沉淀物； ③ 凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离； ④ 离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的 离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依 据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 ⑤ 亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素 受体、IgG和葡糖球菌蛋白蛋白A（SPA）； ⑥ 制备电泳技术。
三、抗体的纯化和鉴定
1、目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分 2、纯化方法 1）单价特异性抗血清的纯化 单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应。 去除杂抗体 主要方法：亲和层析法（将引起交叉反应的共同抗原交 联到Sepharose 4B柱上，把要处理的抗血清通过亲和 层析柱，共同抗体吸附在柱上，洗脱液则含有特异性 抗体）； 吸附法（指将非特异性抗原液与戊二醛制备成固相吸 附剂按1：10直接加到免疫血清中去除杂抗体）
放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗 原（放射性核素标记）混合，孵育24h后，测定其 结合率（用液体闪烁计数仪测定Ag*－Ab或游离 Ag*）。通常以结合率为50%的血清稀度为效价。 如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血 清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标 记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其 pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。
四. 多克隆抗体的应用与问题 一）应用 免疫学检测 被动免疫治疗和紧急预防 二）存在问题 特异性差, 用于免疫学检测容易 出现交叉反应
(Monoclonal antibody,McAb)
第二节 单克隆抗体
一.概念: 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对 某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均 一性的抗体. 二.B细胞杂交瘤的类型 小鼠-小鼠 大鼠-大鼠 小鼠-人 人-人
2.佐剂
1）定义：与抗原同时或预先注射于机体能增强 机体免疫应答或改变免疫类型的物质. 2）良好的佐剂应当具备以下条件： （1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性 基团构型，从而增强抗原的免疫原性； （2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织 的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓 慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴 度的抗体； （3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞 并使之增生，从而增强了体液免疫； （4）具有无毒性或副作用低的特点。
二、免疫血清的制备
1、免疫动物的选择和饲养
选择动物:哺乳类和禽类 1) 适龄、健壮、无感染 2）抗原与免疫动物种属关系：差异越远越好 3）抗血清量的需要：量大，选用马、羊等大动物，量小，选 用兔、豚鼠 4）实验考虑：如要利用所制备的抗体进行免疫沉淀实验，则 不同种属的抗体与蛋白A（SPA）的结合能力不一样，如人 IgG、兔IgG 、猪IgG 、狗IgG 、猫IgG 、驴IgG等与蛋白A 强烈结合，而羊IgG、牛IgG等与蛋白A较弱结合，鸡IgG不 能与蛋白A结合。 5）抗血清分为R（rabbit）型和H（ horse）型，R型免疫血 清具有较宽的等价带，适于做诊断试剂；H型免疫血清等价 带较窄，一般用于做免疫治疗。