WB原理流程

Western Blot一般流程

电泳 转膜


封闭
一抗杂交

蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳


洗涤
二抗杂交


洗涤
底物显色

蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。
显色反应
注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底， 影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。
关于磷酸化蛋白检测的注意事项：


保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液 中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止 去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！ 使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂 奶粉!（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现 很高的背景。）
“微笑”或“倒微笑”
条带？

转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
条带歪斜或漂移？
单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？

电转仪长期使用导致海绵变薄，“三
明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸


确保膜和胶块Leabharlann Baidu间没有气泡

回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗涤不充分会导致
膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确 ）。

加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 室温25min。 回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min。
短时间多次洗膜较长时间少次洗膜更有效。
Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。
细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain

有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品制备的注意事项：

细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心，收集上清液，加 loading煮样5min
Western blot 实验技术
牛君星
定义：

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测 反应来检测样品的一种方法。 Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方 法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构 变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化 为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min， 尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状 态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的 效率。）
凝胶成份
纯净水（ddH2O）
抗体保存注意事项：
1.收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！ 2.对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -200C。 2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于 10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到 蒸发以及管壁吸附的影响。 2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液 保存在40C，避免再冻起来！ 2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影 响的。 4.长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染 任何时候，绝对避免反复冻融！
转膜的注意事项（二）




避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上 的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间 没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和 过小都会影响转膜效率。 鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合 能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来 源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。



而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹
分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
Western Blot基本原理
Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白 质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目 的基因表达的蛋白成分。
膜的选择
转膜注意事项（一）
泡膜： 转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min （1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶 皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡） 转膜顺序： 阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板 转膜条件： 0.35A 250V 1h40min 冰浴中进行转膜 （具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需 要的转膜时间越长，反之则短。）
封闭（30min）(封闭时间过短会导致背景过深 )

5％脱脂奶粉（如果用生物素标记的二抗，就不能用奶粉封闭，
因为奶粉中含有生物素 ）
BSA（牛血清蛋白） Western Blot 膜封闭液（谷歌生物提供）
一抗、二抗孵育

加入一抗溶液孵育（抗体浓度过高会导致背景较深，过低会导致和
抗原结合不充分，出现假阴性 ）。4 ℃时过夜。
做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。 加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短， 以免样品扩散 电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能 联通），将电压调到90V开始电泳，待marker开始分离时 将电压调到120V，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺
（Arc-Bis）。
30%（29:1） SDS（10%） Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯
酰胺和双丙烯酰胺的聚合）
过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由 基）
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：
缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温
背景太高
原因
1.
膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交 叉反应 5. 抗体浓度过高
1.
2.
对 策
3.
4.
转膜前用转移缓冲液将膜 完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶板洗刷干净
胶不平？ 凝胶漏液？
加入APS和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶 聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐
条带比正常的窄？
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，且竖直的拔 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适