样品的分离,富集和纯化
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50
四、样品前处理方法的发展趋势
• 微量化 • 自动化 • 在线技术
load
inject
SPE-HPLC
51
On-line SPE
• 基本仪器组成
SPE预处理柱、分析柱、两个六通阀（或一个十通阀） 和两个独立的高压泵。 • 基本过程
生物基质样品直接或经简单处理后直接进样
高水相比例流动相冲洗预处理柱
4. 固相微萃取 SPME
• 上世纪八十年代后期出现的技术
• 原理
吸附/萃取 （熔融SiO2纤维）
解析
• 可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品 预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度
特点：操作简便、不需溶剂、费用低廉、效率高、 选择性好、适应性好
28
（1）SPME装置
• 主要由两部分组成： 萃取头 控制杆
含有颗粒 阻塞系统
除去微粒
有许多干扰色谱分析的 化合物
减少干扰杂质，改善分 离的效果
有利于色谱柱及仪器的 保护
3
3. 样品的前处理重要性
† 占样品分析时间的比例
样品前处理所占整个分析时间~2/3
† 占分析的消耗总成本最大
消耗大量的溶剂及其他化学品
† 实验的重复性及准确性最差的环节
影响实验结果好坏的最重要因素
15
例：SPE的作用（不同提取过程的结果比较）
乙腈提取 固相萃取
16
（2） SPE技术—形式和填料类型
小柱（cartridge） 96孔提取板/Elution提取板（plate） 提取柱（on-line column/cartridge）
柱体
过滤膜/筛板
硅胶（ Silica ） C18/C8 MCX / MAX / WAX / WCX
46
MI—SPE
分子印迹－固相萃取步骤
目标分子
识别位点
杂质
Condition 非极性溶剂
loading
Washing 非极性溶剂
Elution 极性溶剂
47
方法特点
MI—SPE
• MI－SPE技术节省溶剂，洗脱液的体积较 小(mL级)，浓度较高；基质和干扰物质少， 纯度较高
• 可以直接注入GC、HPLC等仪器进行样品 分析。能够降低检出限，提高分析的精度 和准确性。为提高效率，
• 完成整个提取、分离、浓缩、 测定过程
• 方便携带 • 分析对象 固体、液体和气体
29
（2）SPME步骤
直接 顶空
sampling washing elution Injecting in test equipment
30
（3）SPME涂层
极性 中等极性 极性
均相 复合
近年来，随着SPME技术的发展，各种新型涂 层和涂渍技术不断涌现。
人体血液中氰化物 局部麻醉药 乙醇
20%
20% 15% 5%
33
基质 待测物
顶空SPME 任何基质
挥发/半挥发
直接SPME 气、液态干净样品
多数化合物
金华火腿挥发性风味物质分析 采用顶空SPME，GC－MS得到的总离子流图
34
5.液相微萃取（LPME）
上世纪90代发展起来的技术 萃取机制基于LLE，灵敏度也与LLE相媲美 集采样、萃取和浓缩于一体 环境友好
化合物分子为模板合成的聚合物， 对模板分子具有较高的特异性识别能力
43
例如：阿特拉律分子印迹聚合物的反应原理示意图
a: MI-SPE B:C18-SPE 水样分析色谱图
44
分子印迹技术
分子印迹聚合物的特点 molecularly imprinted polymer MIP
• 制备简单，能够反复使用， • 机械强度较高，稳定性好。 • 非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材
颗粒直径 柱床效率 柱外体积 柱长 塔板数 (N)
HPLC
~5 µm high low 5-30 cm ~10,000
SPE
40-80 µm high low ~1 cm < 50
retention mechanism.
20
HPLC与SPE比较－分离效率
Normalized concentration
质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未 被去除。
分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无
内标，分析重现性不佳)
11
2. 液液萃取 (Liquid Liquid Extraction)
复杂样品的分离、富集和纯化
1
一、样品前处理的重要性
1. 样品分析过程
• 样品采集 • 样品前处理 • 分析测定 • 数据处理和结果报告
样品 (分解)
样品
(被测物)
分离、富 集和纯化
分析
2
2. 样品前处理的目的
感兴趣的某特定化合物 的浓度太低，仪器难以 检测
浓缩微量的组份
提高检测的灵敏度及选 择性
料来分离富集复杂样品中的分析物，以达 到分离净化和富集的目的。
45
（2）分子印迹固相萃取技术 MI—SPE
• 上世纪九十年代出现的技术 • 与常规SPE一样，MI—SPE将微量 MIP(通
常为50～500 mg)填充入萃取柱中使用。整 个萃取过程包括预处理、加样、除杂质和 洗脱4个步骤，均需用到相应溶剂
柱切换，两柱串联
待测组分洗脱入分析柱中分离检测
52
SPME-HPLC
53
SPME－SFC
54
固相微萃取、吹扫捕集与经典顶空法检测限比较
化合物 二氯甲烷
最小检测限（g/L）
直接进样 顶空 固相微萃取 吹扫捕集
80
0.7
12
0.05
氯仿 苯 甲苯 间二甲苯
240
1.5
8.6
0.04
17
0.1
0.3
31
（4）条件选择和影响因素
纤维表面固定相 试样量 试样浓度
• 平衡时间 • 萃取时间 • 萃取温度 • 顶空温度/体积 • 盐浓度 • pH
32
（5）应用
• 各种环境类样品
水，土壤，大气
Total：6500
40%
• 食品分析
• 临床和医学 • 基础研究 • 其他
丙烯酰胺 亚硝胺 有机磷、有机氯 挥发性风味成分
37
（3）应用
• 环境监测
• 食品分析
多环芳烃 苯及其衍生物 芳香胺 酚类
• 生物分析
血样 尿样 毛发
防腐剂和抗氧剂的LPME-GC-MS
安定及其代谢物 可卡因及其代谢物
38
吹扫捕集进样
39
几种样品前处理技术的比较
（分析挥发性有机物）
富集方法 LLE SPE
SPME LPME 顶空 吹扫捕集
操作性 简便 简便
在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白 质沉淀，然后经离心去除
步骤：
• 吸取一定体积血浆 • 加入适量有机溶剂 • 高速混合 • 离心取上清液 • 以水稀释后进样
10
特点：
简单快速 可被自动化，适用于高通量分析 若检测限要求不高时较适用 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白
0.003
20
0.2
0.18
0.003
26
0.2
0.13
0.003
操作简便 富集倍数高 不消耗试剂，不污染环境
55
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
5
10
15
20
5
10
15
Elution volume (mL)
20 21
（3） SPE的一般策略
• 萃取机制取决于分析物与固相表面的活性基 团之间的分子间作用力
• 目的和作用 除去杂质及干扰组分
把样品按照不同极性分组 富集痕量的组分
• 还可与HPLC等装置在线联用
48
GC A. MIP-SPE B. SPE C18
GC A. MIP-SPE B. LLE (heptane-methylene chloride 4:1)
49
（4）分子印记固相微萃取技术 MI－SPME
两种形式 • 管内MI－SPME • 将MIP涂在SIO2表面
简便 复杂
溶剂 消耗较多 消耗较多
不需 极少 不需 不需
40
SPE
SPME
LPME
1970年代
1980年代
处理过程 溶剂使用 富集效率 在线联用
1990年代
☞选择性
41
6.分子印迹技术 MI-SPE和MI-SPME
分子印迹固相萃取 Molecularly Imprinted -Solid Phase Extration 分子印迹固相微萃取
甲醇和水
样品水溶液 5%甲醇水溶液
甲醇
活化及平衡
上样
操作技巧：流速
清洗
(可选步骤)
洗脱
被测组分
24
对流速的一般要求
活化及平衡 上样 清洗 洗脱
5 -10 mL/min 0.5 - 5 mL/min - 液流不能成线 1 - 5 mL/min 0.5 - 5 mL/min- 液流不能成线
25
26
27
分类
7
三、样品前处理的各种方法
பைடு நூலகம்
方法
沉淀 液液萃取 固相萃取 渗析/超滤 电泳 蒸馏/蒸发 超临界萃取
选择性基础
溶解度 样品在两相中的分配 样品在吸附剂上的吸附与分配 分子量与体积 电荷/淌度 沸点与蒸气压 样品在超临界流体中的分配
8
生物样品前处理技术
被测物在样 品基质中 提取 分析
9
1. 蛋白沉淀法
Prepare sample solution
Condition
1mL methanol/1mL water
Load
Wash
Elute Evaporate & reconstitute
14
（1）特点
可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物
并浓缩样品
分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 分析结果的精密度提高(RSD <5%) 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求
色谱柱床 (吸附剂)
插口/出液口
17
固相提取技术的色谱基础 液相色谱如何实现分离？
固定相
被测物 A
B A
流动相
被测物 B
18
如何在反相色谱条件下获得保留？
弱极性 — 非极性
固定相 （吸附剂）
弱极性 — 非极性
物质A
C18 - Silica
水溶性 -- 极性
流动相
极性
物质B
19
HPLC 与SPE的比较
22
SPE的一般策略
• 洗脱干扰物质，保留目标组分
– 干扰物质K 0 – 目标组分K值较大
• 浓缩目标组分
– 目标组分K值较大，且上样体积大 – 洗脱被浓缩组分 – 提高灵敏度
• 洗脱感兴趣的组分，保留干扰物质
– 目标组分K 0 – 干扰物质K值较大
23
（4） 固相提取过程的一般步骤
•以反相提取为例
Molecularly Imprinted -Solid Phase Micro Extration
42
（1）分子印迹技术 molecularly imprinted MI
功能单体和印迹分子 形成复合物
加入交联剂制的高聚物 （将复合物冻结）
共价键 非共价键 半共价键
原位聚合 本体聚合 悬浮聚合
除去印迹分子，留下空穴 （分子识别位）
是决定性的步骤
4
二、 样品前处理技术分类
样品形态 样品和杂质的性质 目标任务
5
样品形态 固态
液态
气态
索氏提取 微波辅助萃取 超临界萃取
液液萃取 固相萃取 吹扫捕集
固体吸附剂法 全量空气法
分类
6
状态和性质
• 固体颗粒
离心 过滤
• 样品和杂质化学 性质的差异
沉淀 液液萃取 固相提取 离子交换 蒸馏挥发
根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物 从一相提取至另一相中。
步骤：
有机层 水层
12
特点：
装置简单 操作容易 常被认定为成本低廉 费时费力 常因乳化效应使相间分层不彻底
导致重复性较差
消耗大量的有机溶剂。
13
3. 固相萃取 (Solid Phase Extraction)
依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将 其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法）
1.进样器 2.样品溶液 3.有机溶剂 4.搅拌子 5.搅拌器
35
（1）萃取方式
悬滴液相微萃取 Single Drop ME
液相微萃取/ 后萃取
多孔中空纤维膜 液相微萃取
LPME/BE Hollow Fibers LPME
顶空液相微萃取 Headspace LPME
36
（2）影响因素
• 有机溶剂的种类 • 液滴大小 • 搅拌速度 • 平衡时间 • 盐效应和pH
四、样品前处理方法的发展趋势
• 微量化 • 自动化 • 在线技术
load
inject
SPE-HPLC
51
On-line SPE
• 基本仪器组成
SPE预处理柱、分析柱、两个六通阀（或一个十通阀） 和两个独立的高压泵。 • 基本过程
生物基质样品直接或经简单处理后直接进样
高水相比例流动相冲洗预处理柱
4. 固相微萃取 SPME
• 上世纪八十年代后期出现的技术
• 原理
吸附/萃取 （熔融SiO2纤维）
解析
• 可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品 预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度
特点：操作简便、不需溶剂、费用低廉、效率高、 选择性好、适应性好
28
（1）SPME装置
• 主要由两部分组成： 萃取头 控制杆
含有颗粒 阻塞系统
除去微粒
有许多干扰色谱分析的 化合物
减少干扰杂质，改善分 离的效果
有利于色谱柱及仪器的 保护
3
3. 样品的前处理重要性
† 占样品分析时间的比例
样品前处理所占整个分析时间~2/3
† 占分析的消耗总成本最大
消耗大量的溶剂及其他化学品
† 实验的重复性及准确性最差的环节
影响实验结果好坏的最重要因素
15
例：SPE的作用（不同提取过程的结果比较）
乙腈提取 固相萃取
16
（2） SPE技术—形式和填料类型
小柱（cartridge） 96孔提取板/Elution提取板（plate） 提取柱（on-line column/cartridge）
柱体
过滤膜/筛板
硅胶（ Silica ） C18/C8 MCX / MAX / WAX / WCX
46
MI—SPE
分子印迹－固相萃取步骤
目标分子
识别位点
杂质
Condition 非极性溶剂
loading
Washing 非极性溶剂
Elution 极性溶剂
47
方法特点
MI—SPE
• MI－SPE技术节省溶剂，洗脱液的体积较 小(mL级)，浓度较高；基质和干扰物质少， 纯度较高
• 可以直接注入GC、HPLC等仪器进行样品 分析。能够降低检出限，提高分析的精度 和准确性。为提高效率，
• 完成整个提取、分离、浓缩、 测定过程
• 方便携带 • 分析对象 固体、液体和气体
29
（2）SPME步骤
直接 顶空
sampling washing elution Injecting in test equipment
30
（3）SPME涂层
极性 中等极性 极性
均相 复合
近年来，随着SPME技术的发展，各种新型涂 层和涂渍技术不断涌现。
人体血液中氰化物 局部麻醉药 乙醇
20%
20% 15% 5%
33
基质 待测物
顶空SPME 任何基质
挥发/半挥发
直接SPME 气、液态干净样品
多数化合物
金华火腿挥发性风味物质分析 采用顶空SPME，GC－MS得到的总离子流图
34
5.液相微萃取（LPME）
上世纪90代发展起来的技术 萃取机制基于LLE，灵敏度也与LLE相媲美 集采样、萃取和浓缩于一体 环境友好
化合物分子为模板合成的聚合物， 对模板分子具有较高的特异性识别能力
43
例如：阿特拉律分子印迹聚合物的反应原理示意图
a: MI-SPE B:C18-SPE 水样分析色谱图
44
分子印迹技术
分子印迹聚合物的特点 molecularly imprinted polymer MIP
• 制备简单，能够反复使用， • 机械强度较高，稳定性好。 • 非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材
颗粒直径 柱床效率 柱外体积 柱长 塔板数 (N)
HPLC
~5 µm high low 5-30 cm ~10,000
SPE
40-80 µm high low ~1 cm < 50
retention mechanism.
20
HPLC与SPE比较－分离效率
Normalized concentration
质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未 被去除。
分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无
内标，分析重现性不佳)
11
2. 液液萃取 (Liquid Liquid Extraction)
复杂样品的分离、富集和纯化
1
一、样品前处理的重要性
1. 样品分析过程
• 样品采集 • 样品前处理 • 分析测定 • 数据处理和结果报告
样品 (分解)
样品
(被测物)
分离、富 集和纯化
分析
2
2. 样品前处理的目的
感兴趣的某特定化合物 的浓度太低，仪器难以 检测
浓缩微量的组份
提高检测的灵敏度及选 择性
料来分离富集复杂样品中的分析物，以达 到分离净化和富集的目的。
45
（2）分子印迹固相萃取技术 MI—SPE
• 上世纪九十年代出现的技术 • 与常规SPE一样，MI—SPE将微量 MIP(通
常为50～500 mg)填充入萃取柱中使用。整 个萃取过程包括预处理、加样、除杂质和 洗脱4个步骤，均需用到相应溶剂
柱切换，两柱串联
待测组分洗脱入分析柱中分离检测
52
SPME-HPLC
53
SPME－SFC
54
固相微萃取、吹扫捕集与经典顶空法检测限比较
化合物 二氯甲烷
最小检测限（g/L）
直接进样 顶空 固相微萃取 吹扫捕集
80
0.7
12
0.05
氯仿 苯 甲苯 间二甲苯
240
1.5
8.6
0.04
17
0.1
0.3
31
（4）条件选择和影响因素
纤维表面固定相 试样量 试样浓度
• 平衡时间 • 萃取时间 • 萃取温度 • 顶空温度/体积 • 盐浓度 • pH
32
（5）应用
• 各种环境类样品
水，土壤，大气
Total：6500
40%
• 食品分析
• 临床和医学 • 基础研究 • 其他
丙烯酰胺 亚硝胺 有机磷、有机氯 挥发性风味成分
37
（3）应用
• 环境监测
• 食品分析
多环芳烃 苯及其衍生物 芳香胺 酚类
• 生物分析
血样 尿样 毛发
防腐剂和抗氧剂的LPME-GC-MS
安定及其代谢物 可卡因及其代谢物
38
吹扫捕集进样
39
几种样品前处理技术的比较
（分析挥发性有机物）
富集方法 LLE SPE
SPME LPME 顶空 吹扫捕集
操作性 简便 简便
在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白 质沉淀，然后经离心去除
步骤：
• 吸取一定体积血浆 • 加入适量有机溶剂 • 高速混合 • 离心取上清液 • 以水稀释后进样
10
特点：
简单快速 可被自动化，适用于高通量分析 若检测限要求不高时较适用 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白
0.003
20
0.2
0.18
0.003
26
0.2
0.13
0.003
操作简便 富集倍数高 不消耗试剂，不污染环境
55
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
5
10
15
20
5
10
15
Elution volume (mL)
20 21
（3） SPE的一般策略
• 萃取机制取决于分析物与固相表面的活性基 团之间的分子间作用力
• 目的和作用 除去杂质及干扰组分
把样品按照不同极性分组 富集痕量的组分
• 还可与HPLC等装置在线联用
48
GC A. MIP-SPE B. SPE C18
GC A. MIP-SPE B. LLE (heptane-methylene chloride 4:1)
49
（4）分子印记固相微萃取技术 MI－SPME
两种形式 • 管内MI－SPME • 将MIP涂在SIO2表面
简便 复杂
溶剂 消耗较多 消耗较多
不需 极少 不需 不需
40
SPE
SPME
LPME
1970年代
1980年代
处理过程 溶剂使用 富集效率 在线联用
1990年代
☞选择性
41
6.分子印迹技术 MI-SPE和MI-SPME
分子印迹固相萃取 Molecularly Imprinted -Solid Phase Extration 分子印迹固相微萃取
甲醇和水
样品水溶液 5%甲醇水溶液
甲醇
活化及平衡
上样
操作技巧：流速
清洗
(可选步骤)
洗脱
被测组分
24
对流速的一般要求
活化及平衡 上样 清洗 洗脱
5 -10 mL/min 0.5 - 5 mL/min - 液流不能成线 1 - 5 mL/min 0.5 - 5 mL/min- 液流不能成线
25
26
27
分类
7
三、样品前处理的各种方法
பைடு நூலகம்
方法
沉淀 液液萃取 固相萃取 渗析/超滤 电泳 蒸馏/蒸发 超临界萃取
选择性基础
溶解度 样品在两相中的分配 样品在吸附剂上的吸附与分配 分子量与体积 电荷/淌度 沸点与蒸气压 样品在超临界流体中的分配
8
生物样品前处理技术
被测物在样 品基质中 提取 分析
9
1. 蛋白沉淀法
Prepare sample solution
Condition
1mL methanol/1mL water
Load
Wash
Elute Evaporate & reconstitute
14
（1）特点
可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物
并浓缩样品
分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 分析结果的精密度提高(RSD <5%) 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求
色谱柱床 (吸附剂)
插口/出液口
17
固相提取技术的色谱基础 液相色谱如何实现分离？
固定相
被测物 A
B A
流动相
被测物 B
18
如何在反相色谱条件下获得保留？
弱极性 — 非极性
固定相 （吸附剂）
弱极性 — 非极性
物质A
C18 - Silica
水溶性 -- 极性
流动相
极性
物质B
19
HPLC 与SPE的比较
22
SPE的一般策略
• 洗脱干扰物质，保留目标组分
– 干扰物质K 0 – 目标组分K值较大
• 浓缩目标组分
– 目标组分K值较大，且上样体积大 – 洗脱被浓缩组分 – 提高灵敏度
• 洗脱感兴趣的组分，保留干扰物质
– 目标组分K 0 – 干扰物质K值较大
23
（4） 固相提取过程的一般步骤
•以反相提取为例
Molecularly Imprinted -Solid Phase Micro Extration
42
（1）分子印迹技术 molecularly imprinted MI
功能单体和印迹分子 形成复合物
加入交联剂制的高聚物 （将复合物冻结）
共价键 非共价键 半共价键
原位聚合 本体聚合 悬浮聚合
除去印迹分子，留下空穴 （分子识别位）
是决定性的步骤
4
二、 样品前处理技术分类
样品形态 样品和杂质的性质 目标任务
5
样品形态 固态
液态
气态
索氏提取 微波辅助萃取 超临界萃取
液液萃取 固相萃取 吹扫捕集
固体吸附剂法 全量空气法
分类
6
状态和性质
• 固体颗粒
离心 过滤
• 样品和杂质化学 性质的差异
沉淀 液液萃取 固相提取 离子交换 蒸馏挥发
根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物 从一相提取至另一相中。
步骤：
有机层 水层
12
特点：
装置简单 操作容易 常被认定为成本低廉 费时费力 常因乳化效应使相间分层不彻底
导致重复性较差
消耗大量的有机溶剂。
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3. 固相萃取 (Solid Phase Extraction)
依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将 其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法）
1.进样器 2.样品溶液 3.有机溶剂 4.搅拌子 5.搅拌器
35
（1）萃取方式
悬滴液相微萃取 Single Drop ME
液相微萃取/ 后萃取
多孔中空纤维膜 液相微萃取
LPME/BE Hollow Fibers LPME
顶空液相微萃取 Headspace LPME
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（2）影响因素
• 有机溶剂的种类 • 液滴大小 • 搅拌速度 • 平衡时间 • 盐效应和pH