单细胞藻类

第二章单细胞藻类培养

第二章单细胞藻类培养

* 一、单细胞藻类的种类与生物特性

* （一）单细胞藻类培养的种类

* 常用的饵料微藻主要有：

* 牟氏角毛藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体；* 三角褐指藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体、种贝；

* 中肋骨条藻：虾、蟹幼体；

* 底栖舟形藻：鲍、海参、海胆、埋栖贝类、舔食螺类的附着幼体；

* 底栖卵形藻：同上；

* 等鞭金藻：贝、虾、蟹、海参、海胆的幼体；

* 亚心形四片藻：轮虫、卤虫、种贝及虾的后期幼体；

* 海水小球藻：同上；

* 钝顶螺旋藻：虾、蟹幼体及配合饲料的添加剂；

（二）单细胞藻类的生物学

* 1、盐度：

* 大多数单胞藻盐度适应范围很宽。

* 10-40大多数单胞藻能适应。

* 如扁藻、盐藻、小球藻在10-80的盐度中能正常生长。

2、温度

* ①适温

* 绿色巴夫藻10-35℃；

* 扁藻7-30 ℃；

* 盐藻4-40 ℃。

* 因此大多数单细胞藻类适合在20-25 ℃下培养。

* 一些单胞藻适合在较高温度下生存；如钝顶螺旋藻生存最适为28-34 ℃。

②低温

* 单胞藻一般忍耐性较强，在一定的低温条件下产生的形态和生理变化是可逆的。

* 利用其在低温环境下呈休眠状态的特点，可较长时间保存单细胞藻类。

* 如在-20 ℃温度下，冰冻20d的三角褐指藻浓缩藻液，解冻后，培养2d即可恢复正常生长。

3、光照

* 5000-10000lx，适合大多数单细胞藻类的培养。

* 某些藻类适合在弱光下培养：

* 如中肋骨条藻：5000lx较适宜，而10000lx 产生抑制作用）；

* 三角褐指藻：3000-5000lx

* 某些单细胞藻适合较强的光照：

* 等鞭藻：7000-9000lx

* 角毛藻:10000-15000lx

* 某些单细胞藻类适合在强光下培养：

* 如钝顶螺旋藻：30000-35000lx

4、pH

* 7.5-8.5是大多数藻类的适宜范围。

* 也有一些藻类适合碱性条件：

* 如钝顶螺旋藻8.6-9.5。

5、繁殖

* 主要以二分裂繁殖为主。

* 可将培养过程分为：延缓期、对数（指数）生长期、相对生长下降期、静止期和衰亡期。

二、藻种的分离

* （一）采样

* 个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。

* 但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料微藻，一般个体很小，往往在几微米到十几微米，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回实验室处理。

* 水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻种的数量较多时，可立即进行分离，若数量少，必须先经过预备培养，待数量增多后再分离。

（二）预备培养

* 1、容器：

* 通常采用三角烧瓶。

* 2、培养液：

* 各种藻类的培养液存在差异。

* 土壤抽出液Ⅰ:取土壤1kg，加纯水1000ml，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤，以滤液600ml加纯水400ml。

* 土壤抽出液Ⅱ：取土壤1kg，加纯水1000ml，再加入NaOH2-3g，煮沸120min，冷却后过滤，滤液直接使用。

* 土壤抽出液Ⅲ：取土壤1kg，加纯水

2000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧瓶中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上清液，再煮沸煎浓。第三天在如法煎浓，最后倾入三角烧瓶中，加棉花塞，煎浓，直至得到1000ml 的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸灭菌保存。

* 土壤抽出液Ⅳ：取田园土壤1kg，加水2000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清，煮沸消毒后使用。

* 海泥（或土壤）抽出液Ⅴ：用海滩上砂质较少，有机物较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置1-2min，待粗砂，小石沉下，把上层泥浆倾入铝锅内，弃去底部粗砂，小石等杂物。静置24h，吸取上清液使用。

3、管理

3、管理

3、管理

（三）分离方法：

* 1、微吸管分离法：

* 选直径约5mm的细玻璃管，在酒精喷灯上

加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。* 微吸管的另一端套接一条长约30cm或8cm 的医用乳胶管。

* 在分离操作时长乳胶管的另一端用牙齿咬紧，如用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。

* 将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察挑取要分离的藻类细胞，吸取时把微吸管对准藻细胞，然后牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入，接着吸入的水滴放入另一凹玻片上，观察是否是目标单胞藻。

* 然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞棉塞，在适宜光照下培养。每天摇动一次。

2、水滴分离法

* 将微吸管插入水样中约2cm深，提取微吸管，待无水滴自然滴下，把微吸管与载玻片接触，即有一小水滴水样留在载玻片上。* 按照上述方法，吸取水滴3-4滴，水滴作直线排列，相互间隔一段距离。然后在显微镜下观察每个水滴，如果某一水滴中藻细胞

只有一个需要分离的藻细胞，即用培养把水滴连同藻类细胞冲入试管中，并加入培养液到试管容量的1/4，试管口塞上棉花塞，放在适宜光照下培养，每天摇动一次。

3、平板划线法

* 方法同光合细菌。

* 由于单细胞藻类大多不适合在固体培养基中生长，因此，分离效果较差。

二、单细胞藻类的培养方式

* （一）纯培养与单种培养：

* 1、纯培养：纯培养即无菌培养，是指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。

* 2、单种培养：在生产性培养中是不排除细菌存在的，为了区别而称单种培养。

（二）开放式培养和封闭式培养

* 1、开放式培养：是把藻类培养在敞开的广口玻璃瓶，水族箱等容器中进行培养，设备简单，为目前主要的培养单细胞藻类的形式。* 特点：充足的光照和通风，繁殖迅速。

* 容易受敌害生物的污染。

* 2、封闭式培养：在封闭容器中进行培养，