多药耐药基因的临床意义与检测方法

多药耐药基因的临床意义与检测方法1MDR概念
肿瘤细胞耐药性可分为内在性耐药(intrinsic drug resistance)和获得性
耐药(acquired drug resistance)两类，既原发地存在于某些肿瘤中，称内在性耐药；继发于化疗后，称获得性耐药。

根据耐药谱可分为原药耐药(primary drug resistance,PDR)和多药耐药(multidrug resistance,MDR)。

PDR只对诱导原药产生耐药，而对其它药物不产生交叉耐药。

而MDR是一种药物诱发，而同时对其它多种结构和作用机制完全不同抗癌药物产生交叉耐药。

内在性耐药原因仍不清楚，而获得性耐药是由于变异耐药肿瘤细胞亚群过渡生长所致。

内在性耐药与获得性耐药作为一种独特耐药现象是成功地治疗肿瘤关键性难题，因而成为近几年国内外研究和探索热点。

2MDR耐药机制
1970年Biedler和Riehm首先描述了MDR表型：一种药物诱导产生耐药细胞株可用对其它多种化学结构和功能完全不同化疗药物产生耐药。

他们发现对放线菌D耐药细胞，同时也对多种抗肿瘤抗生素如柔红霉素等，以及结构与作用机制迥异植物碱类抗肿瘤药如长春新碱等交叉耐药。

1976年，Juliano等最先在耐药中国苍鼠卵巢细胞中发现一种新与耐药程度呈数量关系高分子量细胞膜糖蛋白，命名为P糖蛋白(p-glycopratain,p-gp)。

因其分子量为170kda，又名pgp170，认为此蛋白可降低细胞膜对药物通透性而引起耐药。

后来又陆续研究发现在不同来源多药耐药细胞中这种P糖蛋白分子量范围在130～180kda，主要集中在150～180kda，它由多药耐药基因MDR编码。

近十几年，国外已从耐药肿瘤细胞株中分离出耐药基因MDR1和它表达P糖蛋白。

1986年chen等克隆了编码P糖蛋白cDNA［2］。

2.1MDR基因家族
在哺乳动物，MDR基因是一较小相对保守基因家族。

在人类基因组中，它含有两个基因MDR1和MDR2，在啮齿类由三个基因组成：MDR1，MD R2，MDR3。

2.2MDR基因
基因图谱研究表明人类MDR两种基因定位于第7号染色体q21.1带3 30kb中。

含有28个外显子，28个外显子序列与cDNA完全一致，cDNA
全长4.5kb。

在不同细胞系中MDR1启动子显示活性不同，其增加子活性亦不同，因此MDR1表达呈组织特异性。

2.3MDR基因表型
MDR基因表型是与其基因产物P糖蛋白有关。

许多研究表明，MDR 表型表现为MDR基因过度表达伴有或不伴有基因扩增。

研究发现，在耐药程度低耐药细胞系，可无MDR基因扩增，只有MDR基因表达增加(即mR NA表达增加，P糖蛋白功能增强)。

此时低度耐药细胞P糖蛋白功能增加是由于mRNA转录水平增高，而非基因拷贝增加所致。

MDR表型最突出特点是其编码P糖蛋白功能增加而导致产生了多药耐药性。

因此P糖蛋白是MDR基因表型标志。

2.4P糖蛋白
MDR基因编码P糖蛋白是分子量约为170Kda胞膜蛋白，由1280个氨基酸组成，同源双链，每条链有6个跨膜疏水区，其构成三个跨膜孔有一个细胞内核苷糖连接点可能与ATP连接并发生水解作用。

通常认为，P糖蛋白具有一种能量依耐跨膜药物外输泵功能，当肿瘤细胞与抗癌药物接触时，脂溶性药物浓度梯度进入细胞，而P糖蛋白则结合药物分子，同时其A TP结合位点连上A TP，ATP水解后释放能量将药物从胞内泵出胞外，药物在胞内浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，出现耐药现象。

人类MDR1和MDR2两种基因分别编码了两种结构相似，功能不同P 糖蛋白，MDR1和MDR2两种基因及其所编码两种P糖蛋白具有高度同源性，其同源性达80%，然而这两种基因产物表达却呈组织特异性而且有不同生理功能。

MDR1表达产物可将亲脂类化疗药泵出细胞外，因而有耐药特性；MDR2表达产物则主要分布在骨骼肌纤维上，可将肌纤维代谢产物，如激素等转运到膜外，无转运亲脂类药物功能，故不具多药耐药性作用。

然而在最近研究报告中这种基因仍然作为一个重要提示，即治疗前髓性白血病B细胞出现高表达［1］。

3在正常组织及肿瘤组织中MDR1基因表达
3.1在正常组织中MDR1基因表达
认识P糖蛋白在体内正常表达进行和功能是重要。

P糖蛋白在正常人体细胞内也有表达，表明MDR基因并非异常基因，P糖蛋白并非是一种异常蛋白，而且具有一定生理功能。

了解MDR1基因在正常组织中表达，具有三个作用。

(1)为了建立一个肿瘤中MDR1表达增加基线。

(2)增加我们关于正常P-gp生理功能知识。

(3)更好了解在缓解人类肿瘤耐药方面潜在作用。

正常组织中分为高、中、低三个表达水平。

肾上腺、肾脏高水平表达；肺、肝、结肠、空肠、直肠中等表达；而皮肤、骨骼肌、心肌、脾、食道、胃、卵巢、骨髓等则低表达或不表达。

可以发现MDR1表达主要是在具有分泌和排泄功能器官组织特殊上皮细胞中，其功能为降低有害外源性物质对细胞损害，具有正常生理保护功能。

维持血脑、血睾丸及血胎盘屏障(脑组织及睾丸组织血管内皮细胞、胎盘滋养叶细胞MDR1基因表达水平高)。

已有报道MDR基因及其产物在正常细胞防御中起着不可忽略作用，尤其是对化学致癌物及化学毒素防御［1，7，4］。

3.2在实体肿瘤中MDR1基因表达
如前所述，肿瘤细胞多药耐药性分为内在性耐药与获得性耐药两类。

在肿瘤细胞中，MDR1表达与肿瘤细胞组织起源有关。

临床研究发现，实体肿瘤中MDR1基因表达分四组：第一组癌症通常表达高水平MDR1mRN A。

大多数本组肿瘤正常组织中存在中间至高水平P-gp 170表达，如肾细胞癌、结肠癌、肝细胞癌、肾上腺皮质癌、嗜络细胞瘤等。

临床发现这些肿瘤显示出对治疗不敏感性(那就是说存在内在性耐药)。

第二组所包括癌症偶然表达高水平MDR1mRNA(中间MDR1表达水平)、如神经母细胞瘤、软组织肉瘤、乳腺癌，本组肿瘤趋向比第一组治疗效果好，不幸是本组经过化疗后常常得到获得性耐药。

第三组所包括肿瘤罕见MDR1mRNA表达(几乎所有都没检测到或低MDR1表达)如卵巢癌、食道癌、wilm's瘤、膀胱癌、肺癌等。

本组肿瘤通常化疗治疗是有效，但许多肿瘤通过药物刺激将发展为获得性耐药。

第四组包括肿瘤经过化疗后MDR1基因表达水平提高。

3.3在恶性血液学方面检测MDR1基因表达
许多血液失调病人在治疗过程中发展成为耐药。

由此MDR概念产生。

研究白血病病人耐药最大优势是不论治疗前与治疗后都很容易获得肿瘤标本，且不受肿瘤大小、存在部位和血管血流等非耐药因素影响。

因此与实体肿瘤相比恶性血液病人MDR1表达数据是回归性且经过了化疗治疗。

在正常血液细胞内(全骨髓、脾、纯净淋巴细胞)发现低和非常低MDR1水平表达。

在几乎所有类型白血病、多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤不论治疗或未经治疗病人都有MDR1水平增高报道，MDR1水平可以在一个由低到高范围甚至在未治疗病人中出现高水平表达。

我们用非同位素原位杂交方法检测正常人骨髓MDR1mRNA表达阳性率低于10%，强度为弱阳性。

恶性血液病在MDR1表达方面可以分为三个不同组。

第一组MDR1水平通常在未治疗前增高即内在性耐药肿瘤，如CML在其复发期。

第二组为未经治疗癌症病人MDR1水平偶尔提高，如成人急性淋巴性白血病(ALL)、成人急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、何杰金氏淋巴瘤。

第三组，在有些癌症中经治疗复发时，MDR1水平提高，包括ALL、ANLL。

在临床急性白血病研究中发现，MDR1mRNA阳性组缓解率(CR)，明显低于MDR1mRNA阴性组CR，并且MDR1mRNA阳性患者达到缓解而需疗程较MDR1阴性患者长。

有文献报道MDR1基因表达阳性初治患者C R率为27%～60%［7］，而MDR1基因表达阴性者CR率为72%～90%，说明MDR1基因表达是导致诱导缓解失败主要原因。

4MDR1基因表达研究临床意义
研究MDR1基因表达与临床化疗关系，是从分子水平而非细胞水平来探讨肿瘤对化疗药物敏感性与耐受性，可用来预测病人对化疗反应以及化疗过程中疗效判断和监测预后，可望使肿瘤在更高水平上进行治疗和观察，使化疗个体化，临床医生可根据每个病人MDR1表达水平判断耐药程度，合理地制定化疗方案，具体来讲［2］：(1)预测病人对化疗药物敏感性与耐受性，有针对性地选择最有效药物，避免盲目用药，减少不必要毒副作用。

(2)化疗过程中，若MDR1表达逐渐增高，要注意获得性多药耐药性发生，及时调整化疗方案。

(3)在未进行化疗前，MDR1即显高表达，表示存在内
在性多药耐药性，可考虑使用MDR逆转剂配合抗癌药物化疗。

(4)预测肿瘤复发、转移及预后。

(5)在研究中评价MDR逆转药物疗效。

与MDR1基因相关化疗药物包括(1)烷化剂类。

(2)植物碱类抗肿瘤药。

(3)抗肿瘤抗生素类。

(4)激素类等。

通常为分子量大亲脂类化合物。

与MD R1基因无关化疗药物包括(1)抗代谢类药物，如5-氟脲嘧啶等。

(2)铂类化合物如顺铂等［2，5］。

由于MDR相关化疗药物包括了常用抗癌药绝大部分，可供MDR1高表达病人选择使用抗癌药所剩无几。

如何克服?目前研究方向之一是选择逆转剂。

所谓逆转剂机理是，逆转剂能与耐药细胞表面P糖蛋白结合，竞争性抑制P糖蛋白与化疗药物结合，阻止化疗药物从细胞内流出，从而提高细胞内化疗药物浓度，增强化疗效果。

(图1B)目前发现可逆转MDR药物包括(1)钙通道阻滞剂；如异博定。

(2)钙调蛋白拮抗剂：如环胞菌素A等。

(3)抗心律失常药：如潘生丁，心得安等。

目前主要用于临床是异博定(VRP)和环胞霉素A(CSA)，但都存在一定毒副作用。

如果还存在其它耐药机制则影响逆转效果。

5MDR检测方法
随着分子生物学发展，检测手段不断增加。

目前主要从分子水平、蛋白水平、细胞水平多途径展开了研究。

5.1分子水平由于人肿瘤细胞几乎不存在MDR1DNA扩增，因此，无法检测DNA变化，主要是检测MDR1mRNA表达水平。

常用方法包括：RT-PCR、原位杂交(ISH)、Slot-blot(SB)、Northern blot(NB)、RNase保护实验等［12］。

5.2蛋白水平免疫组织化学法(IHC)，免疫荧光等。

常用P-gp特异性单克隆抗体有JSB-1、MRK1、C219、U12、HYB-612等，不同单抗识别不同抗原决定簇，每种单抗特异性和亲合力不完全相同。

5.3细胞水平检测细胞药物输出功能，采用荧光染料如若丹明-123或具有天然荧光柔红霉素与细胞共同培养后，用荧光分光度计测定单个细胞内药物浓度，与对照组比较判定细胞耐药程度。

最近国外使用流式细胞仪，高分析技术(扫描激光和聚焦显微镜)等先进设备对P-gp进行功能检测。

Pi
wneca-Worns等描述一个人造r散射锝洛合物hexakis［99MTC］SESTAMI BI对P-gp170进行功能图象分析。

［99MTC］SESTAMIBI是一脂性具有放射性药物性阳离子其可被多药转移机制主动转导。

这项技术通过有价值r 散射性［99MTC］进行P-gp170功能测试，是一个新颖快速测定人体内肿瘤细胞P-gp170表达方法。

以上各种方法，各有优缺点。

综合评价：(1)敏感性，PCR>ISH>PGP> SB、NB及细胞功能测定。

(2)特异性，PCR、ISH>PGP>SB、NB及细胞功能测定［2，12］。

目前MDR1基因检测强调标准实验重要性。

要求标准实验为：既要有足够灵敏性以检测小体积样本中MDR1基因表达，并且能定量且能区别出正常组织表达还是肿瘤组织表达。

要想达到该标准，几种实验组合会给临床提供更确切信息。

且参与实验室须规范标准化报告及进行质量控制［1，7］。

由于上面介绍这些检测技术不论是在灵敏性方面还是特异性方面都不可避免地受到一因素限制。

这些因素导致我们不论是对正常组织还是恶性肿瘤组织MDR方面检测都出现相互矛盾结果。

当然抗肿瘤药物耐药过程复杂性，及一些外在其它因素如肿瘤组织变异，其它耐药机制存在和低水平MDR标志表达等因素都会导致一些相互矛盾结果。

还有以前治疗因素影响MDR表型及实验时间不适当等因素都会导致MDR表达与引起化疗困难结果不一致。

要解决这些问题我们还有大量工作要做。

作者单位：张真路(430050武汉市汉阳铁路中心医院病理科)
吴人亮(同济医科大学病理教研室)
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