贝克曼流式细胞仪

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流式细胞仪是一个高通量的开发系 统，随着新抗体和新标记的发现和 开发，将在疾病诊断和生物医学的 研究方面为大家发挥更大的作用
降低
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CD4细胞绝对计数



对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意 义，一般认为CUTOFF值为200/ul. 绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起 测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算 出浓度 对任何细胞群体都可以进行绝对计数
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定




Th1细胞：介导细胞免疫、细 胞毒性T细胞的生长和活化 、巨噬细胞的活化、介导 迟发型过敏反应。其功能 亢进将导致炎症慢性迁延 ，器官特异性自身免疫病 ，急性排异反应和接触性 皮炎等的发病和免疫病理 损伤。 Th2细胞 ：介导体液免疫，促 进B细胞的生长、活化和分 化，是IgG1和IgE类抗体的 转换因子，其功能亢进将 导致特异性过敏反应，参 与高IgE综合症和嗜酸性粒 细胞增多症。
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC)
DC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先 天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞 群，没有发现特异性的抗原标记 DC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱 导检测,一般分为两群－PDC,MDC 当前DC检测的方法： 1）Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达 CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行 分析 3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
免疫状态评价： 移植、放化疗等.
DNA含量及细胞周期分析
细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S， G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现 出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并 由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时 期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。 了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可 利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖 抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期： G0、G1、S、G2、M.
细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括 CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关），NKR( 中国科大研究领先项目） 信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的 检测） 新型荧光特异性探针：胞内病原体检测、转录因子检测 、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用 利用分选的细胞进行体内和体外功能研究 与其它定位性的荧光设备联合使用（如 MPE,CONFOCAL,IC100等）
其它重要分子的流式Biblioteka Baidu析的意义


粘附分子：物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞 HOMING，肿瘤的发生可能有很重要的关系，如 CD11C/CD18-CD54与DC成熟和迁移有关；CD209CD102与抗原递呈有关 CD26:移植后造血干细胞表达可能不利于该细胞的 homing，有证据表明抑制造血干细胞有利用移植成功


不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地 构建和表达了MHC分子α3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其 与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直接 标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC 分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者
抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋
白的分析等等。
临床应用
疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据 免疫调节：细胞因子/受体的相互作用 共刺激分子受体/配体的相互作用 发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递 障碍有关 药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果 的监测
Normal Cell Cycle
G2 M
G1 G0
DNA Analysis
s
C o u n t
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800 1000
4N 2N DNA content
1. 2. 3. 4.
肿瘤的早期诊断。 肿瘤的良恶性判断。 观察细胞的增殖状态及周期分布。 疗效监测
细胞功能分析
非特异性的先天免疫细胞



δＴ细胞:占外周血T细胞的10％以下，非抗原依赖型免疫 细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3 量较普通T细胞多 NK细胞：占外周血淋巴细胞8－25％，传染病和肿瘤病 人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型 肝炎的发生和预后可能与NK细胞的表型相关 DC：分布与淋巴组织和外周血，为非成熟状态，遇到相 应的抗原后主要分泌IFN-alpha来发挥左右
应用分类
1、膜表面抗原和胞浆内蛋白分析 2、DNA含量及细胞周期分析 3、定量分析 4、细胞功能分析 5、凋亡研究 6、细胞间相互左右 7、细胞分选
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态
2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系
4.干祖细胞的定量及成分分析.
5.其它:粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及
流式细胞术在移植中的应用

移植配型和群体反应性抗体的检测 荧光示踪标记的移植细胞：CFSE是一个确定的荧光标 记物，开发其它稳定的荧光素应该更有帮助
流式细胞仪分选


为达到最高的分选效率，实用中最好先用磁珠分选系 统进行初步分选 活细胞分选非常有用
流式细胞术在生物医学研究的新方向




根据产生的细胞因子的类 型和生物学功能,人的ＣＤ4+Ｔ 细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔｈ2 Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的免 疫反应、迟发性过敏反应,并在 清除病毒等细胞内致病因子方 面起着重要作用 Ｔｈ2细胞分泌ＩＬ 4、ＩＬ 5 、ＩＬ 6、ＩＬ 10、ＩＬ 13 等细胞因子,主要促进体液免疫 反应,中和胞外病原体 相应地，CD8+T细胞也可以分 为Tc1和Tc2

T细胞分析

相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病 自身免疫病 AIDS SARS 慢性活动性肝炎、 肝硬化 肿瘤 降低 降低 降低 CD3 CD4 降低 严重 降低 降低 降低 CD8 增高 增高 降低 正常 或 增高 增高 CD4/CD8 降低 降低 降低 降低 降低 降低 NK 降低
CD4CD25 Treg



调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免 疫耐受，太弱会引起自身免疫反应 调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈 调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越来 越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-1?) CD25也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光 强度不足够强
Cell Lab IC 100 细胞群定量

0.8
Complete data mining and analysis Flexible Analysis Plug-in architecture Scalable across an enterprise
0.7 0.6
FLIN
0.5 0.4 0.3
Th1Th2检测Tips

一定要确定T细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，胞 膜打孔是否有效

一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC标记时） ，以便分别部分弱表达的细胞因子。
TETRAMER

抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细 胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效 应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上 述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通 量分析仪器对标本中这群细胞进行分析 四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测 可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测 定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分 选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是 对有功能的细胞进行检测。