动物细胞培养贴壁处理方法
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
动物细胞贴壁的原理
动物细胞贴壁的生长机理?
悬赏分：0 |解决时间：2011-3-7 17:50 |提问者：星级少年
最佳答案
你说的是细胞培养的时候吗？
细胞培养过程添加的血清中会含有贴壁因子，细胞就是考这些贴壁因子而贴壁生长的，一般的，细胞都会贴壁生长，但是经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域，趋势是使用无血清的悬浮培养为主。
细胞不贴壁一样可以生长。
如果把贴壁的细胞洗下来最常用的办法就是加入胰酶消化，37℃环境下放置3～5min便可，但是残留培养瓶内的胰酶对细胞有毒性作用，所以都会添加低浓度的血清以中和胰酶的。
用超声的办法也可以把细胞分离下来，但是要注意超声的频率不能太大，而且细胞很娇嫩，超声会导致细胞的破裂。
这是由细胞的性质特点决定的
有些细胞是必须要附着在支持物上才可以生长的，比如肝细胞，胃上皮细胞等等而有些细胞可以悬浮生长，比如骨髓细胞白，血病细胞等等
这些细胞的生长都是需要添加血清的，而不是有些人说的，加入血清后会贴壁。
贴壁法原代培养
贴壁法原代培养
1.取得组织（手术组织等），尽量在无菌状态下置于10％DMEM＋双抗培养液中，冰上保
存。
以下步骤在超净台内操作：
2.组织用PBS涮5遍。
（如果为非无菌条件下取得的动物组织，如皮肤等，先用75％酒精
涮一遍）
3.按照图示方法取得最终大约2cm2大小的组织块。
这种做法的目的是为了减少获得污染组织的几率。
4.将2cm2大小的组织块置于6cm培养皿中，在组织上加3－4滴10％DMEM＋双抗培养
液（防止组织干掉），用剪刀剪碎成大约米粒大小。
注：组织块不宜太小，否则不利于细胞爬出生长。
5.将剪碎的组织移入6孔板中，用镊子等将组织块比较紧密的排列在板底。
无需加入培养
基，因为剪组织的时候，组织上沾有培基。
如图示。
注：组织快之间的距离不宜太密，也不宜太疏，否则均不利于细胞生长。
6.将6孔板倒置于37度培养箱中，培养6-8hr，使组织块在孔板中贴牢。
7.正置6孔板，加入10％DMEM没过组织块
注：可以选择加双抗或不加双抗，加双抗时细胞生长较慢，有时会发生没有细胞爬出的情况，在初始组织基本无菌时尽量选择不加双抗培养。
8.无需换液，一般3天后能观察到细胞从组织块中爬出。
当培养基变黄时新加适量培养基。
等到细胞基本长满孔板时，按照正常传代方式进行传代培养。
注：勿忘冻存细胞，保种！。
哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养.pdf
三、实验操作——传代培养
1、细胞房及超净台的紫外线消毒，时间约30min-1h。 2、准备材料：完全培养基，0.25%胰酶，PBS，75%乙醇，培养瓶，并且预热培养用液：把装有培养 液、PBS和胰酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 3、用酒精棉球擦拭实验台和双手，正确摆放使用的器械（保证足够的操作空间，不仅便于操作而 且可减少污染）；点燃酒精灯（注意火焰不能太小）。 4、从培养箱内取出细胞（若是培养瓶，注意取出细胞时要旋紧瓶盖），用酒精棉球擦拭显微镜的 台面，再在镜下观察细胞。 5、小心用移液枪吸去原培养皿中的培养液；加入2ml的PBS（无Ca2+和Mg2+）清洗贴壁细胞1-2次， 吸去PBS（此步骤中，PBS应小心添加，以免将贴壁细胞吹打损失） 6、加入原培养液1/10体积（量以盖住细胞最好）的胰蛋白酶-EDTA消化，此处为800ul，使细胞间连 接断裂，液体均匀覆盖培养皿，大约2min或培养箱中20s（目测贴壁细胞块状脱落为标准；倒置显 微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；最佳消化温 度为37℃）。 7、细胞消化完毕后，加入适量的培养基（带血清）拮抗以终止消化，并吹打细胞，制成均匀的细 胞悬液（尽量吹打均匀，使细胞分散开。） 8、将细胞悬液转移至1.5mlEP管，离心2-3min，转速控制在2000rpm下，后弃去上清（此步骤旨在 去除可能过度消化产生的细胞碎片）。 9、沉淀用1mlDMEM吹打均匀后，按照下面介绍的方法计数细胞，后按比例分装到已装有新鲜培养 液的培养皿中。（传代细胞的密度应该不低于5×105/ml 。） 10、做好标记，晃动以使细胞铺展均匀（经验为横纵轴方向各晃动20-30下，此处应小心勿让培养 液溅出）。 11、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量， 以及细胞是否铺展均匀。
探究动物细胞的培养与实际应用
探究动物细胞的培养与实际应用华宇新（兰州大学，甘肃 兰州 730000）摘 要：随着近几年我国动物医学的不断发展，对于动物医学的研究工作也越来越多，尤其是动物细胞培养的发展。
因此本文就动物细胞的培养与实际应用进行探究，为进一步促进我国生物医学、科技等方面的发展，提供相关参考。
关键词：动物细胞；培养；实际应用前言动物细胞培养指的是动物活细胞在离散的状态下，通过人工培养的方式进行生长及增殖。
但人工培养下细胞无法形成新的组织，但是却有利于我们对细胞的生长过程进行观察、调控及研究，从而能够通过对动物细胞生长的代谢及染色体形成过程的研究，应用于生物学、遗传学领域的发展中。
因此近几年得到了更广泛的关注，基于此，本文就动物细胞培养及实际应用进行探究。
一、几种动物细胞的培养方法（一）贴壁培养法这种培养方法是将动物细胞做立体培养管理，对细胞培养的过程中动物细胞需要在有适量正电荷固体或半固体上附着，在能实现细胞的生长，并逐渐生长成为单层。
贴壁化培养技术是一种较为经典的细胞培养方法[1]，进行贴壁细胞培养需要先将采集的动物活体组织置于无菌的环境下，之后采用物理法或是化学法将其制作成细胞分散液，并进行过滤、离心、纯化、漂洗等环节，之后将处理好的动物细胞接种到含有培养液的细胞培养皿中，并放到CO 2培养箱中进行细胞的培养。
通过这种方式，能够很好地对观察细胞的生长过程，因此这种方法用场会被应用到实验研究当中。
尽管如此这种细胞培养的方式仍然存在一定的缺陷，就是在细胞贴壁生长的过程中，会产生接触抑制性，会对细胞的生长有一定的抑制作用。
因此产生的细胞数量十分有限，想要获得较多数量的细胞，就需要进行二次培养，将形成单层的动物细胞重复细胞分散液的制作过程，并重新接种，实施传代培养。
（二）悬浮培养法悬浮培养法是应用与悬浮生长的动物细胞的培养，不少不动物细胞都存在这种生长特性，并不需要附着在任何物品上，仅依靠培养液就能够生长。
常见的这种类型细胞有淋巴、肿瘤等细胞。
贴壁动物细胞培养操作流程
贴壁动物细胞培养操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行贴壁动物细胞培养之前，需要做好充分的准备工作。
贴壁细胞处理方法
上海奥陆生物科技有限公司贴壁细胞处理方法一、细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。
从细胞资源中心获得细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作。
二、镜下观察：未超过80%汇合度时，将瓶装的完全培养液移入无菌瓶中，留待日后培养用，原瓶（T25瓶）保留6-8ml完全培养液，放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，按要求比例消化传代。
三、消化方法1、将瓶装的完全培养液移入无菌瓶中，留待日后培养用。
加消化液0.25% Trypsin-EDTA(1X), Phenol Red消化。
2、T25瓶加3ml PBS，洗一次，弃上清，再加1ml消化液消化，显微镜下观察，等细胞完全脱离瓶壁分离成单个后，加培养基混匀，离心收集，按要求分瓶（视细胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6， 1:6-1:8），每T25瓶加培养基至6-8ml，37℃、5%CO2孵箱培养四、若客户收到2ml小管细胞收到细胞以后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超菌台内，严格无菌操作；然后将小管细胞转移至T25培养瓶，加入9ml左右含FBS的培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞汇合度：若未超过80%汇合度，换液继续培养，根据情况传代或者冻存。
若超过80%汇合度，可直接进行传代（方法同上）该细胞使用培养基：1、DMEM(高糖) 2、R1640 3、R1640（改良）4、MEM(EBSS) 5、MEM(NEAA) 6、D/F12 7、F12 8、F12K 9、MaCcoy‘5A 10、L15血清要求：1、20%FBS 2、15%FBS 3、10%FBS 4、5%FBS 5、2.5%FBS 6、15%HS7、10%HS 8、5%HS 9、2.5%HS 10、10%CCF(灭活)四、细胞代数：复苏人：冻存液：常规培养液+20%FBS+8%DMSO。
动物细胞培养技术实验指导(全面)
实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
动物细胞的传代培养
试验动物：贴壁细胞系
动物细胞的传代培养
第4页
试验方法
（贴壁生长细胞传代）
动物细胞的传代培养
第5页
动物细胞的传代培养
第6页
消化数分钟
动物细胞的传代培养
第7页
中止消化、吹散细胞
动物细胞的传代培养
第8页
细胞传代
3. 悬浮生长细胞传代
• 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液
后再混匀传代。
• 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2 一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
动物细胞的传代培养
第3页
试验用具
器材：超净工作台、无菌细胞培养瓶、离心管、 吸管、橡皮塞、酒精灯等
动物细胞的传代培养
动物细胞的传代培养
第1页
试验目标
了解和掌握动物细胞传代培养基础方法及其 操作过程。
动物细胞的传代培养
第2页试验原理1.源自贴壁生长细胞传代• 采取酶消化法传代。常见消化液有0.25％胰蛋白酶液。
2. 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
• 这类细胞个别展现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打 法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
37℃、5％CO2培养
动物细胞的传代培养
第9页
思索题
简述动物细胞传代培养操作程序及注意事项？
动物细胞的传代培养
第10页
动物细胞传代培养技术
• 这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则 对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随 弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上 吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 • 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活 性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反 复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的 温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以 及所加胰酶溶液的多少等。
2悬浮细胞的传代
• • • • 离心， 弃上清液， 加新鲜培养基， 分装传代。
二 细胞系的维持
• 1 做好细胞系的档案记录工作
• 2 遵从细胞生长的规律 • 3 防止细胞间交叉污染 • 4 及时冻存放丢失
• 将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃 去； • 加入0.25%胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积 为0.5ml或更多，以使充分浸润； • 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透 明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰 酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化； • 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到 一传四的比例。
第四的首次传代
• 1 待细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表 面后再传代 • 2 传代时不同细胞有不同的消化时间需注 意观察及时处理，原代消化时间长于传代 • 3 首次传代细胞接种量要多一些，尽快适应 新环境。
二 细胞传代方法
• 1、贴壁细胞的传代方法： • 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生 长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多， 同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对 细胞进行传代扩增。 • 对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后 分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以 胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为 （以下操作 均按无菌操作的要求进行）：
细胞贴壁生长实验报告
1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。
2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。
3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。
这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。
细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。
3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。
4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。
5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。
6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。
2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。
3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。
4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。
六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。
2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。
哺乳动物贴壁培养细胞收集方法-代谢组学
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
贴壁动物细胞培养操作流程
贴壁动物细胞培养操作流程一、前期准备。
咱得先把要用的东西都准备齐全咯。
就像出门旅行要带齐行李一样，细胞培养可不能少了各种家伙事儿。
培养瓶或者培养皿也不能忘，这就是细胞的小房子啦。
要保证它们干净得很，最好是经过消毒的。
还有移液枪，这可是个很重要的工具，就像小滴管一样，用来精确地吸取和添加液体。
二、细胞复苏。
细胞从冷冻状态醒过来可是个大事儿呢。
先把冻存的细胞从液氮罐里小心翼翼地取出来，就像抱个小宝贝一样。
然后快速放到37度的水浴锅里，让它慢慢暖和起来。
这个时候呀，要不停地轻轻晃动，就像哄小宝贝睡觉那样轻轻摇晃。
等细胞融化得差不多了，就把细胞液转移到离心管里，再加点培养基，然后就放到离心机里转一转。
这一转呢，就像给细胞做个小运动，让它们整整齐齐地待在底部。
三、细胞接种。
现在要把细胞放到它们的小房子里啦。
用移液枪吸取适量的细胞悬液，然后轻轻地滴到培养瓶或者培养皿里。
要均匀地滴哦，就像给小房子的每个角落都撒上小种子一样。
然后把培养瓶或者培养皿放到培养箱里，这个培养箱就像个温暖的小窝，里面的温度、湿度和二氧化碳浓度都要调好。
四、细胞换液。
细胞在小房子里生活一段时间后，就像人要换衣服一样，也得给它们换液啦。
先把旧的培养基轻轻地倒掉，可不能太粗鲁，不然会把细胞也弄掉的。
然后再加入新鲜的培养基，就像给细胞换上干净的新衣服。
五、细胞传代。
细胞慢慢长大，小房子住不下了，就得搬家啦，这就是传代。
把培养瓶里的细胞先用胰蛋白酶消化一下，这就像给细胞松松绑，让它们从瓶壁上下来。
然后再把细胞悬液按照一定的比例分到新的培养瓶里，就像把一家人分到几个新的小房子里一样。
六、细胞观察。
咱得时不时看看细胞过得咋样呀。
用显微镜观察细胞的形态、数量什么的。
如果看到细胞长得圆滚滚、健康得很，那就太好啦。
要是看到细胞有点不对劲，比如形状奇怪或者数量突然变少了，那就得好好找找原因，是不是培养基出问题了，还是培养箱的环境不太对呢。
贴壁动物细胞培养就像照顾一群小宠物一样，得细心、耐心，每个步骤都不能马虎，这样细胞才能茁壮成长呢。
贴壁法体外培养纯化鼠骨髓间充质干细胞
贴壁法体外培养纯化鼠骨髓间充质干细胞【摘要】目的研究贴壁法体外分离、纯化及增殖鼠骨髓间充质干细胞（MSCs)，并进行鉴定。
方法取出生5 d的Wistar乳鼠的股骨及胫骨，冲取骨髓，采用贴壁法分离筛选分离鼠的MSCs，通过传代进行纯化，增殖，测定其生长曲线，检测生长周期，流式细胞仪分析表面抗原。
结果贴壁培养法能够有效地分离鼠的MSCs，MSCs形态为均一的梭形，生长曲线呈S型，细胞周期显示第三代细胞约有80.89％处于G0/G1期，第三代以后细胞表面抗原CD90阳性，CD34、CD45阴性。
结论建立了一种较好的体外培养、纯化及扩增鼠MSCs的方法，适用于MSCs的进一步研究。
骨髓间充质干细胞（MSCs)来源于中胚层，具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，而且具有来源广泛、易于培养和移植、体外基因转染率高等特点，显示了在细胞和基因治疗中良好的应用前景，已引起了广泛的关注〔1〕。
本实验研究鼠的MSCs体外分离纯化、培养和鉴定，为进一步探讨MSCs的应用提供基础。
1 材料与方法1.1 材料清洁级出生5 d的Wistar乳鼠（8.0～10.0 g），购自吉林大学实验动物中心。
主要试剂：DMEM培养基（美国GibcoBRL公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），兔抗鼠CD90、CD34、CD45荧光直标抗体（美国BD公司），RNA酶、碘化丙啶(Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(华美生物工程公司)、青霉素、链霉素(华北制药厂)。
1.2 方法1.2.1 MSCs的体外分离与培养选用出生5 d Wistar乳鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡片刻，无菌条件下分离股骨、胫骨，剪除骨两端，用5.0 ml L��DMEM培养基，冲出骨髓于培养皿内，经吹打制成细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清。
用10 mlL��DMEM重悬细胞，将悬液经1.0 ml注射器和200目滤网过滤成单细胞，用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/ml链霉素的L��DMEM培养液重悬。
动物细胞培养制药工艺
动物细胞培养
动物细胞培养技术
2、悬浮培养
概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程。
优点： 操作简单，培养条件相对均一 传质和传氧较好，容易放大培养。
缺点： 细胞体积小 密度低 培养病毒易失去标记而降低免疫能力。
适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。 借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。 培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器
动物细胞培养
动物细胞培养技术
3、半连续式操作
动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产 乙肝表面抗原、t-PA等基因工程产物。
半连续操作特别适用于分泌表达型细胞，如杂交瘤细胞的 培养，尤其是微载体系统。
微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后， 反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。
动物细胞培养
2、流加式操作
动物细胞培养技术
最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。 通过流加控制，可实现高密度培养。
杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4×107，生产抗体的产量 比分批操作提高几～10倍，可达500 mg/L。
由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限 在实际生产中应用少。
动物细胞培养
1、单层贴壁培养
动物细胞培养技术
概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层 细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴 壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。
生长过程：
接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面； 进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。 数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。
动物细胞培养技术
4、微载体培养
微载体
微载体：是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长 的微珠。
贴壁培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞贴壁培养的基本方法。
2. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程。
3. 了解细胞培养技术的基本原理和应用。
二、实验原理动物细胞贴壁培养是一种常见的细胞培养方法，适用于大多数动物细胞。
该方法将细胞悬浮于含有营养物质的培养液中，使其附着于培养皿底部或盖玻片上，形成单层或多层细胞。
在适宜的培养条件下，细胞可进行增殖、分化等生物学活动。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶4. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、盖玻片等四、实验方法1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞取出，用预热的DMEM培养基溶解，37℃水浴箱中复温至37℃，加入10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，制成细胞悬液。
2. 细胞接种：将细胞悬液用移液器吸取，接种于培养皿中，每孔加入2ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养。
3. 细胞传代：待细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
按照1:3的比例传代培养。
4. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程：每隔一定时间，观察细胞在培养皿中的生长状态，包括细胞形态、数量、融合程度等。
五、实验结果1. 细胞复苏：冷冻细胞在37℃水浴箱中复温后，逐渐恢复活力，出现典型的细胞形态。
2. 细胞接种：细胞接种后，约24小时开始贴壁，约48小时形成单层细胞。
3. 细胞传代：细胞传代后，生长状态良好，形态、数量、融合程度与原代细胞相似。
4. 细胞生长曲线：观察细胞生长过程，绘制细胞生长曲线，显示细胞呈指数增长。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了动物细胞贴壁培养，观察了细胞贴壁、生长、增殖过程。
2. 细胞贴壁培养过程中，温度、CO2浓度、pH值等环境因素对细胞生长具有重要影响。
本实验中，CO2培养箱的温度设置为37℃，CO2浓度为5%，pH值稳定在7.2-7.4。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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Corning资料
Corning文献
鼎昊源DHS贴壁细胞生长表面
鼎昊源DHS细胞工厂等贴壁表面采用最新的第三代亲水表 面处理技术：
美国进口高真空环境 射频等离子放电技术 99.9999%纯度进口气体 德国巴斯夫高纯PS原料 最好的贴壁效果：不仅接枝COOH，同时接枝氨基
细胞培养贴壁表面处理方法：
1）聚-D-赖氨酸或胶原包被培养表面 2）表面改性：聚苯乙烯表面接枝羟 基（OH），羧基（COOH），氨基 （NH and NH2）官能团
贴壁细胞的生长特性
细胞培养贴壁表面改性方法：
第一代技术：电晕放电：将空气中氧、氮等电离后接枝到 PS表面 优点：便于自动化生产 缺点：亲水性能不够， 受大气环境影响
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贴壁细胞的生长特性
细胞培养贴壁表面改性方法：
第二代技术：辉光放电：将空气中氧、氮并补充特定气体 电离后接枝到PS表面 优点：便于自动化生产 缺点：亲水性有所增加， 受大气环境影响
贴壁细胞的生长特性
细胞培养贴壁表面改性方法：
第三代技术：真空等离子放电：在真空腔内补充特种气体， 电离后接枝到PS表面 缺点：不便于自动化生产 优点：亲水性优异，性能稳定 不受大气环境影响 可以根据细胞类型采用不同的亲水处理工艺
细胞培养表面化学
2013 by DHS
贴壁细胞的生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上， 细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进 入对数生长期。一般数天后就铺满培养 表面，并形成致密 的细胞单层
贴壁细胞的培养容器
培养瓶、培养皿、培养板等
贴壁细胞的培养容器
大规模培养：转瓶培养、微载体生物反应器、细胞工厂
细胞培养容器的表面化学 细胞培养器皿生长表面必须为亲水表面性能
细胞培养容器的表面化学 培养容器一般采用透明PS（聚苯乙烯）塑 料制成，属于疏水材料
贴壁细胞的生长特性