离子交换层析

实验二离子交换层析纯化兔血清IgG
【原理】
DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。

用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。

血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。

pH7.2 ～7.4 的环境中。

酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。

【试剂与器材】
1. DEAE-Sephadex A-50
2.0.5mol/L HCl 和NaOH
3.0.1mol/L pH7.4 PBS
4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3
6.PEG
7. 无水乙醇
8. 紫外分光光度计
9.1cm×20cm 玻璃层析柱
10. 自动部分收集器
【操作步骤】
1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。

按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有
2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。

2 ．装柱
（1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

（2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。

待A-50 凝胶沉降 2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。

（3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速
4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。

并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。

松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱
面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2 ～3 次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。

并控制流速，4 滴/min.
5 ．收集开始洗脱的同时就以试管进行收集；每管收集4ml. 共收集10 ～15 管。

6 ．测蛋白以751 型紫外分光光度计分别测定每管A 260 ，按公式计算各管蛋白含量。

并以A 280 为纵坐标，绘制洗脱曲线。

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7 ．合并、浓缩将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG （Mw6000 ）浓缩至所需体积，加入0.02 ％NaN 3 防腐，于4℃ 保存备用。

长期保存时应贮于-40℃ 冰箱。

8 ．A-50 凝胶的再生在柱上先以2mol/L NaCl 洗脱杂蛋白至流出液的A 280 <0.02 ，再以蒸馏水洗去柱中盐。

然后按预处理过程将A-50 再处理一遍即达再生。

近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃ 保存；近期不用时，以无水酒精洗2 次，再置50℃ 温箱烘干，装瓶内保存。

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。

本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。

50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。

目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将
吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。

结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，
使之成为带H+或OH-的交换剂型。

阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。

已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。

为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。

柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。

样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。

为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。

柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。

为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。

由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。

最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高
盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。

当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。

洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。

②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。

③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。

目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。

依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。

如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。

保存离子交换剂时要加防腐剂。

对阴离子交换剂宜
用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。

有些产品建立用0.02％叠氮钠。

⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。

在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。